蛋白质组双向电泳原理及实验步骤课件.ppt

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1、中南大学湘雅医学院精神卫生1201班吴所谓方圆蛋白质组双向电泳蛋白质组（Proteome）：在一种细胞内存在的全部蛋白质。蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双向电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。原理Theory实验操作Method应用Application+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦–chargesize第二向：SDS-PAGE电泳+pH3pH7.5pH10样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstri

2、pequilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）双向电泳实验流程样品制备基本原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。可溶性样品固

3、体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。双向电泳样品的溶解是成功进行双向电泳的最关键因素之一溶解的目标：样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；保证样品在电泳过程中保持溶解状态。溶解的手段：离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质MoreDatawithNarrowRangeIEFpH3-

4、10pH3-6pH5-8pH7-10BroadRangeSeparations聚焦时间的优化要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。两维间的平衡等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分

5、离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。二维SDS-PAGE同普通SDS-PAGE类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。操作Method样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Stai

6、ning）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）双向电泳实验流程最高电压10,000V10–25C温度控制7,11,17,18,和24cm的聚焦盘，可以各放12根胶条可以储存10个程序，每个程序有10步程序可进行时时编辑可供选配的打印机等电聚焦的操作等电聚焦程序的设置7cm胶条水化12小时（17℃）被动水化S1250V慢速30分钟除盐S21000V快速60分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速24,000伏小时聚焦~28,000伏小时S5500V快速任意

7、时间保持l选择所放置的胶条数。l设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根）l设置等电聚焦时的温度。（17℃）配制SDS-PAGE凝胶配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。聚合30分钟。待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。胶条的平衡冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。配制胶条平衡缓冲液I。吸去胶条上的矿物油及多余的样品。第一次平衡。振荡15分钟。配制胶条平衡缓冲液II。第二次平衡，振荡15分钟。吸去玻璃

8、板中液体。将玻璃板倒扣在