蛋白质组实验流程双向电泳制备

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1、蛋白质组实验流程双向电泳的样品的制备样品制备原则样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent

2、系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducingagents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的

3、去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。一、细胞样品1.细胞培养，加药与处理。2.胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5mi

4、n)，弃上清,再次离心，去尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用10mMTris/250mMSucrose(pH117.0)代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。加入5倍体积裂解液，混匀（或将1×106细胞悬于60～100µl裂解液中）。1.加50ug/mlRNase及200ug/mlDnase，在4℃放置15分钟。2.15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。3.收集上清。4.测定蛋白浓度(采用BioRadRC/DCproteinassaykit)。5.分装样品，冻存于－70℃。二、组织样品1.碾

5、钵碾磨组织，碾至粉末状。2.将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分钟。4.15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。5.收集上清，测定蛋白浓度。6.分装样品，冻存于－70℃。注意事项：1.8mmol/LPMSF必须在添加还原剂之前用，否則PMSF会失去活性。2.40mmol/L浓度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。3.细胞清洗――大多用PBS，若PBS残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10mmol/LTris,250

6、mmol/LsucrosepH7.0)來解決此问题。双向电泳操作步骤水化上样(被动上样)1.从冰箱中取出IPG胶条，室温放置10min。2.沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm左右不加样，中间的样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。3.用镊子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。4.将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上.注意:不要将样品溶液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。5.放

7、置30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。6.置等电聚焦仪于-20℃水化11~15h。第一向等电聚焦1.将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O5~8µl润湿。111.取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。2.将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。3.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油。4.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。5.聚焦结束的胶条，立即进

8、行平衡、第