多聚酶链式反应PCR技术课件.ppt

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1、多聚酶链式反应(PCR)一、PCR技术概念：是一种体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用：DNA复制原理①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链;③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器.二、PCR技术的原理DNA双链单链变性（加热95℃）复性（缓慢冷却55℃）4、DNA分子的热变性原理：变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合三、使用PC

2、R的前提是：已知目的基因(或DNA片段)两侧的序列，根据该序列化学合成反应必需的双引物。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。四、PCR条件：四种脱氧核苷酸;耐高温的DNA聚合酶;两种引物;模板；缓冲溶液严格控制温度的温控设备。DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入解旋解旋酶加热变性引物引物合成酶外源加入底物细胞内源外源加入DNA聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’-OH端为3’磷酸基团的末端为5’复制的方向：子链的5’端向3’端延伸温泉中水生嗜热杆菌DNA聚合酶是

3、从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在1000C条件下，能保持几个小时。而其最适温度在720C左右。引物引物是决定PCR结果的关键。*引物长度以15～30个碱基为宜，引物过长会影响与模板的退火效率。*(G＋C)含量最好保持在约40%～60%，(G＋C)含量越高退火温度越高，退火温度过高过低都不利于PCR的反应。*两个引物之间不应发生互补。*引物浓度要适宜.用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。快速、高效、灵活、易于操作五、PCR技术的特点六、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外

4、源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液体内DNA复制和PCR不同点解旋（解旋酶；高温解旋）引物（RNA；人工合成的DNA单链）DNA聚合酶（耐不耐高温）反应环境（细胞内环境；缓冲溶液）六、PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备.2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变

5、性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到550C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链.靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,57630

6、1,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量七、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增;①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸;八、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪微量离心管微量移液器（二）、PCR的反应过程每个循环

7、包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环—复性PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR整个过程反应程序95℃5分钟，1个循环；95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃延伸7分钟。反应产物在4℃保存。反应结束后用紫外分光光度计测定扩增产物的D

8、NA含量或用琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。循环数变性复性延伸第一次95°C，10m