环介导等温扩增_LAMP_技术的应用现状_郭浩.pdf

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1、畜牧与兽医2012年第44卷第5期·87·环介导等温扩增(LAMP)技术的应用现状121*13郭浩，杜景娇，云彩麟，刘小雷，于东升(1．内蒙古医学院，内蒙古呼和浩特010059;2．大连医科大学，辽宁大连116044;3．内蒙古精神卫生中心，内蒙古呼和浩特010010)摘要:LAMP技术具有简便、快速、高效、特异性强等优点，尤其适用于人类和动物疾病的检测，本文重点论述了目前LAMP方法在病原微生物检测、临床诊断、胚胎性别鉴定以及转基因食品等领域的应用及研究情况。表明该方法已具有成功应用的现实性，为快速基因检测提供了一种新的技术途径，可望作为常规检测工具。关键词:环介导等温扩增;病原

2、微生物检测;临床诊断;胚胎性别鉴定;转基因食品中图分类号:Q52文献标识码:A文章编号:0529-5130(2012)05-0087-05随着分子生物学的发展和人们不断对传统核酸扩F3引物:上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由［1］增技术的改进，2000年Notomi等报道了一种新F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物:颖、便捷、灵敏度高的核酸扩增方法，即环介导等温下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)。B2区域组成，B2区与靶基因3

3、'端的B2c区域互补，其特点是针对靶基因的6个特定区域设计4种特异性B1C域与靶基因5'端的Blc区域序列相同。B3引物:引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApoly-下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域merase)在恒温条件(65℃左右)下保温几十分钟，组成，和靶基因的B3c区域互补(如图1)。即可实现核酸的扩增。反应结果可通过反应副产物焦1.2扩增原理磷酸镁白色沉淀的形成进行肉眼观察，或者通过浊度60～65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，仪检测焦磷酸镁白色沉淀的混浊度来判定，也可在反DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在

4、应管中加入荧光染色试剂，在紫外灯下观察，对反应此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种［2－4］产物进行实时监测。LAMP方法不需要模板的热高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在［5］变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察不停地自我循环。扩增分两个阶段:等过程，是生命科学领域最具价值的工具之一。环介第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链导等温核酸扩增技术对食品微生物检测及临床医学上DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就传染性疾病、转基因食品和胚胎性别鉴定等特性的诊会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首断具有独特的应用价值。先与模板F2c结合，在

5、链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板1LAMP技术原理F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单1.1LAMP引物设计链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我LAMP引物的设计主要是针对靶基因的6个不同碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物的区域，基于靶基因3'端的F3c、F2c和Flc区以及BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引铃状结构的单链。迅速以3'末端的Fl区段为起点，物。FIP(ForwardInnerPrimer):上游内部引物，由以自身为模板，进

6、行DNA合成延伸形成茎环状结构。F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3'端的F2c区第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模域互补，F1C区与靶基因5'端的Flc区域序列相同。板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3'末收稿日期:2011-10-12端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合基金项目:国际科技合作项目(2009DFA32720)，“十一五”国成、延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结家科技支撑计划(2009BAK61B04)。构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮作者简介:郭浩(1987-)，

7、男，硕士，研究方向:心血管药理扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添学及抗精神病药理学。E-mail:guohao851@163.com。*通信作者:云彩麟，教授，研究方向为:中蒙药药理及药效学加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构研究。E-mail:yuncailin@126.com。结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是·88·AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2012Vol.44No.5具有不同个数茎环