试验双缩脲法测定蛋白质含量课件.ppt

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1、实验双缩脲法测定蛋白质浓度实验目的1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习蛋白质含量测定的原理和方法3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法原理：物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，常用紫外—可见分光光度法。光的电磁波性质射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光分光光度法定性分析与定量分析的基础物质对光的选择吸收A在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。A

2、C增大定性分析基础定量分析基础I0I参比样品入射光I0透射光I一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。Lambert—Beer定律A=εCLT（透射比）=I/I0=10-CLlg(1/T)=CLA为吸光度；ε为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度应用（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。（3）比较吸光度的比值纯DNA1.标准曲线法配制一系列不同浓度的标准溶液（至少5个）按测定管同样方

3、法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度（A），以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度（C）为横坐标，制作标准曲线。根据样品的A从标准曲线上查得样品含量，再计算出样品的浓度。常用方法标准系列未知样品标准曲线与样品的测定条件必须一致。待测样品的浓度必须在标准曲线范围内。2.标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。3.摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。）分光光度计的使用单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示紫外-可见分光光度计1．722型分光光度计的外形

4、2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作①打开电源开关，使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色皿架的其它位置，盖好样品室盖。④拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T”键调透射比为零⑤推入比色皿架使参比溶液位

5、于光路中，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比⑥按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式A，此时应显示为0，如果不是则按“100%T”再调A零⑦将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数⑧实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。在签名本上签名。返回光路返回光路返回美谱达V-1100D可见分光光度计测量前的准备开机自检：确认仪器光路中无阻挡物，关上样品室仪器电源开始自检预热：仪器自检完成后进入预热状态，预热时间需在30分钟以上使用说明测量模式选择：按MODE键可切换测量模式设置波长：转动波长旋钮可设置测试波长，

6、波长值可从显示器实时读取校准零位：按▽可校准零位校准100%T：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△可校准100%T测量吸光度第一步：按MODE键选定模式为“A”模式第二步：旋转波长旋钮到测试波长第三步：将放有“参比”的样品槽置于光路中，按△校准100%T第四步：将放有“样品”的样品槽置于光路中，读取吸光度值752型分光光度计美谱达UV-1200紫外-可见分光光度计蛋白质含量测定的原理和方法微量凯氏定氮法被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，

7、然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。消化CO2+SO2+H2O+NH3↑+浓H2SO4NNH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏H2O+Na2SO4+NH3↑(NH4)2SO4+NaOH吸收NH3+H3BO3NH4HB4O7+H2O滴定NH4HB4O7+HCl+H2ONH4Cl+H3BO3氮的总量测定—凯氏定氮法原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一

8、分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，