运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株.docx

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1、应用微生物技术实验设计班级：姓名：学号：运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株一.实验目的1.学会从土壤中筛选到植酸酶菌株。2.掌握紫外诱变菌株的方法。3.学会从变异的菌株中筛选高产菌。二.实验原理植酸（又称为肌醇六磷酸）在多种植物组织（特别是米糠与种子）中作为磷的主要储存形式，其结构是肌醇的6个羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物。植酸以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内，也存在于动物有核红细胞内，可促进氧合血红蛋白中氧的释放，改善血红细胞功能，延长血红细胞的生存期。植酸本身就是对人体有益的营养品，植

2、酸在人体内水解产物为肌醇和磷脂，前者具有抗衰老作用，后者是人体细胞重要组成部分。植酸酶，是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。具有特殊的空间结构。植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。以微生物的自然变异作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6

3、~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株，利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和sephadex G-100 凝胶

4、过滤层析对植酸酶进行分离纯化。三.实验材料1.材料（1）筛选培养基：1%植酸钙，3%葡萄糖，200U/ml青霉素钠，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO4.4H2O，0.05%MgSO4.7H2O，0.003%FeSO4·7H2O，1.5%琼脂，pH5.5。（2）液体发酵培养基：1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.003%FeSO4.7H2O，pH5.5。（3）查氏

5、合成培养基：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15~20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。（4）斜面培养基：0.05%MgS04·7H2O，0.003%MnSO4·7H2O，0.003%FeSO4·7H20，麸皮汁100ml，1.5~2%琼脂，pH5.5。（5）土壤：去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm-10cm的土壤。2.仪器水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉、

6、干燥箱、超净工作台、移液管等四.实验步骤1.流程土壤样品稀释液测量各透明圈与菌落直径的大小 初筛保藏菌种 菌种鉴定复筛4 6 8 10 去离子水(ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 钒钼终止液 2 2 2 2 2 2 OD值        按表1加入试剂后，在415nm波长下测OD值，并绘制标准曲线。  复筛测酶活保藏菌种制备单孢子菌悬液紫外诱变 4 6 8 10 去离子水(ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 钒钼终止液 2 2 2 2 2 2 OD值        按表1加入

7、试剂后，在415nm波长下测OD值，并绘制标准曲线。  复筛 菌种鉴定 紫外诱4 6 8 10 去离子水(ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 钒钼终止液 2 2 2 2 2 2 OD值        按表1加入试剂后，在415nm波长下测OD值，并绘制标准曲线。  复筛 菌种鉴定 紫外诱变平板初筛摇床复筛 测酶活 保藏菌种分离纯化 2.方法（1）菌株的筛选：土壤样品稀释1×10^5倍，涂布于筛选培养基上，30℃培养72h，挑取产生透明圈的菌株。对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛，在220r/mi

8、n的转速下发酵培养，测其酶活。-[崔志芳,刘娜,季爱云.植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化[J].中国酿造.2010(07)]（2）酶活的测定：钒钼酸铵法略加改进后进行测定。取1ml粗酶液加入2ml植酸钠溶液并摇匀（对照加入2ml钒钼终止液），37℃保温反应30min，立即加入2ml钒钼终止液（对照加入2ml植酸钠溶液），415nm测OD值，参照磷标准曲线计算酶活。酶活定义：按上述方法，在pH5.5的条件下，每分钟从0.0051mol的植酸钠溶液中释放