H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用-论文.pdf

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1、中国动物传染病学报2014，22(1)：16—24ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases·研究论文·H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用申伟霞1,2田巧珍，陈圆，胡涛，闫丽萍2李国新，李雪松，滕巧泱，赵宇军，李泽君(1．山西农业大学动物科技学院，太谷030801；2．中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241)摘要：虽然H3、H9亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)是低致病性禽流感病毒，但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力，对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害

2、，因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了分别针对H3AIV和H9AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示，这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV，且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19一T-H3HA和pMD19．T-H9HA10倍梯度稀释液为模板，进行敏感性实验。结果表明，本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3AIV和10个DNA拷贝数的H9AIV，比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外，本方法还能检测到10EID的H

3、3亚型AIV或H9亚型AIV，比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3％，表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外，与传统PCR方法相比，用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检；NA-~感染动物的肺组织时，针对H3AIV的敏感性提高了10～100倍，针对H9AIV的敏感性提高了100倍。综上所述，本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性，对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。关键词：H3；H9；禽流感病毒；荧光定量PCR中图分类号：$852．659．5

4、文献标志码：A文章编号：1674—6422(2014)01—0016—09DEVELoPMENTANDPRELIMINARYAPPLICATIoNoFFLUoRESCENTQUATI11ATIVEPCRASSAYFoRDETECTIoNoFH3ANDH9SUBTYPESoFAVIANINFLUENZAVIRUSSHENWei．xia’，TIANQiao—zhen，CHENYuan2HUTao，YANLi—ping。，LIGuo—xin，LIXue．song，TENGQiao．yang，ZHAOYu-jun，LIZe-jun2(1．Collegeofani

5、malscienceandtechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801．China：2．ShanghaiVeterinaryResearchInstitute，CAAS,Shanghai200241，China)Abstract：AlthoughH3andH9subtypesofAvianinfluenzavirus(AIV)arelowpathogenicinbirds，theyhaveadaptedabilitiestoinfectmammalians，whichposespotentialt

6、hreattohumanbeings．Therefore，surveillanceofH3andH9subtypesofAIVisimportantforpublic收稿日期：2013-l2-18基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2011AA10A200)；国家自然科学基金项目(31302115)；中央级公益性科研所基本科研业务费专项资金项目(2013JB06)；公益性行业(农业)科研专项(201003012)；上海市科委现代农业领域重点科技攻关项目(12391902000)作者简介：申伟霞，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：李泽君，

7、E—mail：lizejun@shvri．ac．cn；赵宇军，E—mail：tgzhaoyujun@l63．com；滕巧泱，E—mail：tengqy@shvri．ac．cn第22卷第l期申伟霞等：H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用health．Inthepresentstudy,TaqManprimersspecificforeitherH3orH9subtypeweredesignedtodevelopfluorescentquantitativePCR(qPCR)bycomparingthehomologyofHAgen

8、esequencessubmiRedontheGenBank．Thespecif