烟草青枯病菌土壤拮抗细菌的筛选及鉴定-论文.pdf

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1、江苏农业科学2014年第42卷第6期·——99-——陆铮铮，蒋选利．烟草青枯病菌土壤拮抗细菌的筛选及鉴定[J]．江苏农业科学，2014，42(6)：99—102烟草青枯病菌土壤拮抗细菌的筛选及鉴定陆铮铮，蒋选利(1．遵义师范学院生命科学学院，贵州遵义563002；2．贵州山地农业病虫害重点实验室／贵州大学农学院，贵州贵阳550025)摘要：为筛选出烟草青枯病菌的拮抗细菌，从贵州省天柱县、黄平县及大方县烟草根围土壤中共分离出65株细菌。采用平板喷雾法筛选获得20株拮抗细菌，且抑制效果稳定，其中有2株拮

2、抗细菌平均抑菌圈直径大于20mm，分别为c3—5(39．98mm)和C5—3(48．88mm)。采用16SrDNA序列分析以及形态特征、培养性状、染色结果等方法进行鉴定，结果显示，c3—5为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，C5—3为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericu)。关键词：烟草青枯病；拮抗细菌；生物防治；筛选；鉴定；蜡样芽孢杆菌；球形赖氨酸芽孢杆菌中图分类号：S435．72文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014)06—0099—03青枯

3、病病原菌原名为茄假单胞杆菌(Pseudomonus平板划线分离法进行分离、纯化。鉴定为烟草青枯病病原solanacearumE．F．Smith)，1995年更改为茄劳尔氏菌(砌菌后，用蘸根接种法回接，待发病后，再分离和纯化病原stoniasolanaz~．arumE．F．Smith)。烟草青枯病是一种典型菌，并采用灭菌蒸馏水保存方法保存备用】。的维管束细菌性土传病害，最显著的症状是枯萎。该病害广1．1．2土壤样品从贵州省天柱县社学乡、黄平县白塘村及泛分布于热带、亚热带等50多个国家和地区，在我国南方

4、普大方县双山镇的烟草种植地中选择发青枯病的烟田，从中采遍存在且危害严重，它具有发病快、危害重、损失大等特点，且集健康烟株的根围土壤，共12份。常与黑胫病和空茎病混合发生J，给防治带来了较大的困1．1．3培养基及试剂难。目前，对于烟草青枯病的防治还是以化学防治为主，近几1．1．3．1分离和筛选培养基烟草青枯病病原菌和土壤细年研究者们筛选出了许多对烟草青枯病有较好抑制效果的药菌的分离以及对峙培养所采用的培养基均为牛肉膏蛋白胨琼剂，如30．2％芽敌水剂、72％农用硫酸链霉素以及1B。脂培养基(NA)。石硫

5、合剂等药剂。但是化学农药会对环境造成污染，威胁1．1．3．2细菌鉴定培养基马铃薯块斜面培养基：将马人畜的健康和安全，且随着施用年限和浓度的增加，易导致病铃薯洗净去皮，切成长3．5～4．0cm、宽0．5CI1"1的楔形薯块斜原菌产生抗药性。随着烟草青枯病防治研究的不断深入，生面。为防止薯块干燥，先在试管底部放1团吸饱水的棉花，再物防治已成为防治该病害的研究热点，尤其是通过筛选根围将薯块粗的一端向下放入试管中，塞上棉塞，常规灭菌。为了土壤中的拮抗菌与病原菌竞争营养和生存空间的方法，降低中和细菌分解淀粉而

6、产生过多的酸，可在灭菌前于薯块斜面病原菌的繁殖率，从而有效控制病害，且对环境无污染，是一上加少量碳酸钙。牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3—5g、种绿色的防治方法。土壤是一切自然环境中细菌的总发源蛋白胨10g、NaC15g、蒸馏水1000mL，pH值7．0～7．2。地，在土壤中存在着许多对人类有益的细菌，它们具有分解或1．1．3．3细菌鉴定染色剂革兰氏染色剂和芽孢染色剂者合成的作用，是人类的功臣。可以说，土壤为筛选拮抗(孔雀绿染色剂)。细菌防治植物病害提供了很多的细菌资源。且细菌容易分1．2方法离、繁

7、殖较快，是生物防治的理想菌种。因此，本研究从贵州1．2．1病原菌分离选取烟草青枯病病株发病部位的一小省天柱县社学乡等发青枯病的烟田土壤中筛选出对青枯病菌块组织(0．5cmx0．5cm)制成临时装片，用显微镜观察细菌具有拮抗作用的细菌并进行鉴定。特有的喷菌现象，再选取被检测发病部位周围的组织，采用平板划线分离法分离。1材料与方法1．2．2土壤采集选取种植年限较长且青枯病发生较重的1．1材料烟田，在烟草旺长期采集健康烟株的根围土壤(避免雨季采1．1．1供试菌株从贵州省麻江县五寨乡烟草种植区中选土)。取样

8、时先除去地面落叶和垃圾，拨开表土约5cm深，择发烟草青枯病严重的田块，从中采集病株带回实验室，采用剔除石砾和植被残根等杂物，每份样土约30g(同地区取样点至少相距100m)，装入自封袋并做上记号，带回实验室。1．2．3土壤细菌分离采用稀释平板法：用1／100天平准收稿日期：2013—09—22确称取土样10g，放入装有90mL无菌水的三角瓶中(瓶里放基金项目：中国烟草总公司贵州省公司科技项目(编号：200917)；贵几粒无菌玻璃珠)，置于摇床振荡20min，使微生物细