转化子的筛选与重组子的鉴定.ppt

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1、转化子的筛选与重组子的鉴定www.themegallery.com为什么要进行转化子的筛选和重组子的鉴定？在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子。转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。期望重组子：含有目的基因的重组子。非期望重组子：不含目的基因的重组子。转化子重组子期望重组子三者的关系转化子的筛选

2、与重组子的鉴定方法基于载体遗传标记的筛选与鉴定利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子基于克隆片段序列的筛选与鉴定由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广泛的实用性基于外源基因表达产物的筛选与鉴定如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子基于载体遗传标记的筛选与鉴定抗药性筛选法营养缺陷性筛选法显色模板筛选法噬菌斑筛选法ROPROISalIBamHITc

3、rPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。非重组子：Apr、Tcr重组子：Aps、Tcs抗药性筛选法将外源DNA片段插入BamHI、SalI位点www.themegallery.com将转化液涂布含Ap的平板Ap再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上Ap+Tc影印挑选在Ap平板上生长、但在Ap+Tc平板上不长的转化子为重组子基本操作：www.themegallery.com营养缺陷性筛选法基本原理：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重

4、组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。www.themegallery.comLys−Lys+Lys−Lys+基本原理图示：常见的营养缺陷型筛选标记：哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶www.themega

5、llery.com显色模型筛选法基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。www.themegallery.com显色筛选法的基本操作：pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ

6、+，蓝色菌落www.themegallery.com噬菌斑筛选法重组子非重组子1.取代型载体噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。2.插入型载体根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ′）基于克隆片段序列的筛选与鉴定PCR鉴定法菌落原位杂交法限制性酶切图谱法亚克隆法DNA序列测定法PCR鉴定法PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落分别挑出进一步培养，因此不太

7、适用于成千上万个转化子的鉴定。转化子重组子非期望重组子转化子期望重组子期望重组子受体基因组非整合子整合子工作原理：菌落原位杂交法菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。原位杂交的操作程序探针的制备探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键最佳的探针长度范围为100~1000bp探针内部不能含有