重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选.ppt

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1、重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选?第一节       重组DNA向宿主细胞的导入第二节       转化子的筛选与鉴定第三节       目的基因序列测定第一节       重组DNA向宿主细胞的导入一、转化二、通过接合作用传递质粒DNA三、通过转染/转导作用传递遗传物质一、转化:以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞1928年,美国的Oswald,Avery首次开展了肺炎球菌的转化试验感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期

2、发生，如E.coli。产生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有㈠原生质体转化法；㈡化学转化法；㈢电穿孔法。㈠原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。㈡化学转化法:1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下,用预冷的CaCl2

3、溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内。用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-).2.方法:（1）感受态细菌的制备（2）转化（1）感受态细菌的制备接种一环DH5于2mlLB中37℃，振荡过夜以约1%的接种量接入20mlLB中振荡培养约90’至OD600≈0.2离心（5K，5’）收集菌体加入预冷CaCl2（10ml100mM）冰浴20’离

4、心收集菌体加入100ul100mM预冷CaCl2混匀转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照——10ulPBR322DNAlng100ulb阴性对照①10ul——2ul连接液100ulc阴性对照②——10ul——100uld连接液转化组——60ul6ul连接液600ul（2）转化：0℃，在1.5ml离心管中按下表加入CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验冰浴30’42℃2’（热休克）冰浴，2’加37℃预热LB培养45’表中a、b、c各取100ul/皿涂布（连接液转化组d梯度涂布I50ul2皿；I

5、I.500ul浓缩后2皿）37℃倒置培养过夜检查细菌生长情况㈢电穿孔法原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。它比CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达109～1010个转化子／μgDNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且适用于任何菌株。二、通过接合作用传递质粒DNAF质粒（F因子）又称性质粒,除了含有自我复制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有F质粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。F+菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌

6、）发生接触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F－菌株转变成F+菌株。质粒由F+向F－菌的转移过程叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系（Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传递质粒DNA,F+菌株可失去F质粒,F－菌也可获得F质粒,其转移难以人为控制,又不稳定，通常不用作克隆载体。接合----F+×F－F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、通过转染/转导作用传递遗传物质㈠转染病毒（含噬菌体）DNA及其重组子D

7、NA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。㈡转导以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA,体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA导入宿主菌体内第二节       转化子的筛选与鉴定一、利用遗传标志的表型特征筛选二、根据重组子的结构特征筛选一、利用遗传标志的表型特征筛选㈠由载体提供的性状进行筛选1.抗菌素抗性标记筛选2.抗性基因的插入失活筛选3.β-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选法及其α-互补的

8、原理㈡根据插入基因的遗传性状进行筛选亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长，当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。Ampicillin抗性?yesyesTetracycline抗性?NoyesBXBBBXAmproriAmprTcroriAmprTcroripBR322Bbacktransferofcolonies+ampicillin+ampicillin+tetracycli