普通PCR及测序PCR原理分解ppt课件.ppt

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1、一PCR技术PCR概念PCR的原理PCR中的注意事项PCR的主要类型什么是PCR?多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。PCR反应的几个要素DNA聚合酶生产机器模板（要扩增的DNA）引物dNTPs原料Buffer（缓冲液）稳定的环境Mg2+等润滑剂模具72℃（延伸）95℃（变

2、性）50℃（退火）PCR循环（25-35个）PCR反应步骤模板DNA95℃变性(denaturaion)50℃引物1引物2DNA引物退火(annealing)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶延伸(extension)第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA（1）第1轮扩增（2）第2轮扩增（4）第3轮扩增（8）第4轮扩增（16）第5轮扩增（32=25）标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L上下游引物　　各10～100pmol模板DNA　　　0.1～2ugTaqDNA聚

3、合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1）PCR反应成分（1）模板模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR），既可以是双链，也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）TaqDNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等存在的情况下催化DNA的合成。Taq酶来自水生嗜热菌Thermusaquaticus特点：1.良好的耐热性在70～80℃具有最高聚合活性在95℃仍然可以有50%活性2

4、.Mg2+依赖性3.扩增时3‘末端凸出一个A碱基3.无校正功能一般PCR中酶的用量为0.5-2.5U/50l，酶量增加使反应特异性下降，酶量过少影响反应产量。（3）引物引物浓度：0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物设计：（1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。（4）引物Tm在50℃-65℃之间，两条引物的Tm应接近，不能相差太大。（5）引物内部避免形成二级结构。（6）两引物间避免有互补序列。（7）引物3’端与模板序列

5、要严格配对，3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；引物5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记（4）dNTPdNTP：dATP，dTTP，dGTP，dCTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响

6、反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（6）缓冲液（Buffer）10mmol/LTrisHCl调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）50mmol/LKCL有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性0.01%明胶保护酶不变性失活2）循环参数变性使双链DNA解链为单链95oC20-30秒(2)退火退火温度由引物Tm值决定，一般为Tm–5~10℃增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75oC(温度取决于聚合酶的

7、活性）延伸时间由扩增片段长度及DNA聚合酶的延伸速度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加一个典型PCR体系反应体系（50ul）：Taq酶2.5U10xBuffer5uldNTP(2.5mM)4ulDNA模板0.1～2ug上游引物(10P)2ul下游引物(10P)2ulH2O补足至50ul总计50ul反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）：95℃5min95℃30s55℃30s72℃1min72℃5min4℃------30个循环PCR的特点特异性强灵敏度高PCR产物的生成量是以指

8、数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6)水平简便、快速PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物