第07章__酶分析法ppt课件.ppt

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1、第七章酶分析法第一节酶分析法的基本知识第二节酶活力的测定第三节酶法分析第四节酶循环分析法第五节固定化酶在酶分析中的应用第一节酶分析法的基本知识1.1酶分析法的两种类型1.2酶分析法的特征1.3酶分析法的意义蛋白质属性的酶是高效、高度专一的生物催化剂，它和生命活动密切相关。因此，酶学在生产实践基础理论研究方面，都起着非常重要的作用。酶分析法则是其中的重要内容，也是目前发展较为迅速的一个领域。酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反应的能力，对化学分析有很大的用处。酶的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制剂以及酶

2、本身的测定。在19世纪中叶已采用酶法来测定糖类。20世纪40年代初，Warburg提出基于使辅酶还原而用光度法来测量NAD和NADP的方法。最新的发展是电化学法与荧光法的应用。酶分析法已成为一项公认的分析技术。1.1酶分析法的两种类型一种是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含量或活力的测定，通常称为“酶活力测定”。另一种是以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅因子等，一般称为“酶法分析”。两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效

3、地催化化学反应为基础，通过酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且都需要选择适宜的反应条件和测定方法。1.2酶分析法的特征①选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的。②灵敏度高。一般可测到10-7mol/L。如果与荧光法联用，可高达10-9mol/L左右。③反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在30分钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、常压和pH近中性的条件下，反应速度很快。④酶用量甚微，所以比较经

4、济。⑤精确度一般。主要源于微量吸管误差，如1ul以下的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。⑥适用范围有一定局限性。只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定。⑦简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错。1.3酶分析法的意义酶的应用大致可分为四个方面：(1)

5、用以制造某些产品；(2)用以去除某些物质；(3)用以识别某种化合物；(4)用以测定某种物质。(1)和(2)应用最为广泛。例如用酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。(3)和(4)属于酶分析法的范畴。酶分析法迅速扩展一个原因是由于酶工业的发展，可以方便获得各种酶制剂。第二个原因提由于酶应用形式的发展。由于近十年来酶的固定化技术有了很快的发展，使酶的反复使用和连续使用成为可能。固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。另一方面也正在进一步简便化，

6、或制成含酶的试纸，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等方面广泛应用。如用葡萄糖氧化酶(EC．1．1．3．4)测定血液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定某些酶含量也是临床诊断的重要指标。第二节酶活力的测定2.1酶活力单位和反应初速度2.2反应条件的确定2.3光学法2.1酶活力单位和反应初速度2.1.1酶量常用酶活力单位表示。酶活力单位是指在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量。酶含量则可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示

7、(U/g或U/mL)。①1959年国际生物化学协会酶委会接受了Racker等人的建议，采用了“国际单位”表示酶活力。国际单位IU：25℃，最适pH，最适底物浓度下，每分钟催化1μL底物反应的酶量。当底物为蛋白质、多糖等包括多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键变化表示酶单位；对于反应：A+B→C+D，可用两微摩尔A的变化计算酶单位。②1972年酶委员会又提出一种新单位Katal。在确定的最适反应条件下每秒钟催化1摩尔底物变化所需要的酶量为1Kat。1Kat=60×106IU。③在

8、实际工作中,为了简便，人们往往采用各自习惯沿用的单位。有时甚至可直接用测得的物理量表示。如以光吸收的变化值(△A/△t)表示酶单位。④在估计酶制剂纯度时则用比活力，即以单位重量的酶蛋白中酶的单位数⑤在酶高度纯净，且酶的分子量和每个酶分子上的活性中心数目已知时，可采用分子活力或转换率(TN)表示。TN表示在最适条件下每个酶分子或每个活性中心每分钟催化底物分子(或相关基团)转化的数目，这种单位的意义是它可用以进行酶催化效率的估计和比较。酶活性测