生化技术电泳技术ppt课件.ppt

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1、第三章电泳技术电泳（electrophoresis简称EP）是指带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的想象。一、基本原理㈠不同的带电质粒在相同电泳条件下，质粒移动速度与质粒所带净电量呈正比而与质粒的大小呈反比，即质粒带电荷越多在电场中移动速度越快，质粒的体积或分子量越大移动速度越慢。当电泳到一定时间后停止电泳，不同的质粒会集中到相应的位置形成一条条的分离区带，将不同物质分离开来。如氨基酸、蛋白质、酶、核酸、激素等两性物质溶液，由于不同它们的等电点和分子量是不同的，电泳后形成不同的区带，利用此性

2、质把混合物分离开来。㈡不同的物质由于其带电性质，颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离开。如蛋白质分子，在PH=PI时，正负电荷相等，净电荷为零，蛋白质在电场中不移动；若PH＜PI时，蛋白质带正电荷，向负极移动；若PH＞PI时，蛋白质带负电荷则向正极移动。㈢带电质粒在电场中的移动速度取决于带电的多少和分子的大小。二、影响泳动速度的主要因素：在一定的条件下，任何带电颗粒都具有自己的特定泳动速度，影响泳动速度的因素有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。1、颗粒的

3、性质：即颗粒的直径、形状以及所带的净电荷量。2、电场强度电场强度对泳动速度起到十分重要的作用，电场强度越高，带电颗粒的移动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度的大小将电泳分为常压电泳和高压电泳。常压电泳：多用于蛋白质等大分子物质的电泳分离。高压电泳：多用于氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质的电泳分离。3、溶液性质（1）溶液的PH值溶液的PH值决定带电颗粒的解离度，也即决定其带净电荷的数量。对蛋白质等两性电解质而言，溶液的PH值离其等电点越远，则其所带的净电荷量越多，在电场中移动速度越快。因此分离某混合两性电

4、解质物质时，应选择一个合适的PH，使各物质所带的净电荷量差异大些以利于分离。（2）溶液的离子强度溶液的离子强度越高，质粒的泳动速度越慢，但电泳的区带却较清晰，反之则越快，分离度亦较差。离子强度表示所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，即取决于离子电荷的总数。原因是：1）若离子强度过高，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在周围形成离子扩散，这种静电引力导致颗粒泳动度降低。2）若离子强度过低，溶液的缓冲能力差，不能维持溶液的PH值，改变颗粒泳动速度因此，电泳时溶液的离子强度一般为0.02~

5、0.2之间，电泳较为合适。（3）溶液的粘度溶液的粘度与泳动度成反比关系，粘度过大或过小，必然影响泳动度4、电渗溶液在电场的作用下，对于固体支持物的相对移动称为电渗。1）若支持物带有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠支持物的溶液相对带正电，在电场作用下，此溶液层向负极移动。2）若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，使靠支持物的溶液相对带负电，在电场作用下，此溶液层向正极移动。---------++++++负极A支持物溶液的离子+++++++----------正极B支持物溶液的离子当

6、颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。三、电泳的种类（一）按有无固体支持物分1、显微电泳2、自由界面电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。主要用于研究膜结构以及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。自由界面电泳是胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。在U型管中加入一定量的带色胶体溶液，分别在U型管两端加入等量的缓冲液，两端通直流电，一段时间后会看见一边胶体溶液的界面上升而另一边界面下降。下行界

7、面上行界面缓冲液缓冲液胶体溶液3、区带电泳区带电泳是样品物质在支持物上进行电泳的过程，各个组分因泳动速度的不同而形成不同的带状区间，故称区带电泳。如纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳、淀粉凝胶电泳等。（二）按凝胶浓度不同分分为不连续缓冲系统电泳（如圆盘状凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）、凝胶浓度梯度电泳、连续电泳（如等电聚焦电泳）（三）按电泳槽的种类分有水平平板电泳、垂直平板电泳、圆盘电泳（四）按电泳原理和方式分单向电泳、双向电泳、等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、

8、免疫电泳。圆盘电泳垂直平板电泳标准样品四、电泳常用的支持介质电泳常用的支持介质可分为两大类：1、大孔材料：主要起支持作用，并可阻止对流，减少扩散。如滤纸、醋酸纤维素薄膜、硝酸纤维素薄膜等，蛋白质等物质在这些材料上电泳分离时主要取决于物质的带电量，带电量少的移动慢，带电量多的移动快。2、凝胶材料：除起支持作用和阻止对流，减少扩散外，还兼有分子筛作用。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等，蛋白质等物质电泳分离时既与物质的带电性