常用分子生物学技术(药学本科)ppt课件.ppt

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1、第六章常用分子生物学技术第一节分子杂交技术具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。二、DNA变性是双链解为单链的过程双链间氢键的断裂！2、DNA变性的本质1、DNA变性的概念DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线DNA变性的动态变化过程核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液

2、中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。分子杂交变性复性DNA-DNA杂交双链分子核酸分子杂交探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。一、Southern印迹此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳

3、至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程从凝胶上转移DNA二、Northern印迹应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。其方法类似于Southern印迹杂交。三、Western印迹将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。三种印迹比较1.DNA印迹技术(Southern

4、blotting)检测DNA2.RNA印迹技术(Northernblotting)检测RNA3.蛋白质的印迹分析(Westernblotting)检测蛋白质三种印迹技术的比较四、原位杂交(insituhybridization)1、定义：将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交（hybridizationinsitu)。2、操作步骤：载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针；湿盒原位杂交五、生物芯片c

5、hip生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待检样品用量自动化—提高工作效率低成本—可迅速普及推广1、生物芯片技术的特点2、生物芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的

6、带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫3、生物芯片分类（1）基因芯片（2）蛋白质芯片（3）细胞芯片（4）组织芯片基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是将大量特定序列的DNA片段（分子探针）有序地固定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等支持物上，从而能快速、准确地对大量DNA分子序列进行测定和分析的一种类似电脑的芯片。原理：利用碱基的互补配对原则（DNA分子杂交）材料：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领

7、域。4、基因芯片应用5、制作基因芯片的大致步骤表达芯片的制备检测流程应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。第二节目的基因制备技术KaryMullisresearchscientistinthe1980sataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetusco-winnerof1993NobelPrize一、聚合酶链式反应（PCR）（一）PCR技术发展简史PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室

8、KaryMullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性TaqDNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年KaryMullis等完成了自动化操作装置，使PCR进行实用阶段。1、PCR的基本原理DNA半保留复制机理聚合酶链式反