中国生物工程杂志china biotechnology, 2005, 25(9)69～73 酿酒

《中国生物工程杂志china biotechnology, 2005, 25(9)69～73 酿酒》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(9):69～73酿酒酵母工业菌株中XI木糖代谢途径的建立*沈煜**王颖史文龙刘向勇鲍晓明***曲音波（山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100）摘要根据代谢工程原理，采取多拷贝整合策略，利用整合载体pYMIKP，将来自嗜热细菌Thermusthermophilus的木糖异构酶（XI）基因xylA和酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）自身的木酮糖激酶（XK）基因XKS1，插入酿酒酵母工业菌株NAN27的染色体中，得到工程菌株NAN

2、114。酶活测定结果显示，NAN114中XI和XK的活性均高于出发菌株NAN27，表明外源蛋白在酿酒酵母工业菌株中得到活性表达。对木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明，工程菌NAN114消耗木糖4.6g/L，产生乙醇6.9g/L，较出发菌株分别提高了43.8%和9.5%。首次在酿酒酵母工业菌株中建立了XI路径的木糖代谢途径。关键词木糖酿酒酵母乙醇木糖异构酶木酮糖激酶收稿日期：20050315修回日期：20050614*国家自然科学基金委员会与中国节能投资公司联合研究基金资助项目(50273019),国家重点基础研究

3、发展计划资助项目(2003BC716006、2004CB719702)**现工作单位：江南大学生物工程学院***通讯作者，电子信箱：bxm@sdu.edu.cn燃料乙醇是最有发展前景的环境友好新型能源。木质纤维素是年产量巨大且目前尚未被充分利用的可再生资源，其水解物中木糖的含量仅次于葡萄糖［1］。促进木糖向乙醇的生物转化是充分利用木质纤维素生物质，降低乙醇生产成本的关键环节之一［2，3］。因此，利用代谢工程手段，拓展乙醇转化的底物，对于木质纤维素资源全利用具有重要的理论意义和应用价值。酿酒酵母（Saccharomycescere

4、visiae）是传统的乙醇生产菌株，因缺乏将木糖转化为木酮糖的代谢途径而不能很好地利用木糖［1，3~5］。自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条：其一，木糖经依赖NADPH的木糖还原酶（xylosereductase，XR）还原形成木糖醇，再由依赖NAD+的木糖醇脱氢酶（xylitoldehydrogenase，XDH）催化形成木酮糖［4］。其二，木糖在木糖异构酶（xyloseisomerase，XI）的作用下直接转化木糖形成木酮糖［5］。同时，代谢途径下游的木酮糖激酶（xylulokinase）催化木酮糖磷酸化形成5磷酸

5、木酮糖的酶促反应也是木糖代谢的限速步骤之一［6，7］。由于XR和XDH催化反应需要的辅酶不同，因而在木糖代谢过程中造成氧化还原不平衡，直接导致副产物木糖醇的大量积累［4］。木糖异构酶可以直接转化木糖到木酮糖，不需要辅酶，被认为是构建代谢木糖酿酒酵母工程菌株的便利途径，但许多不同种属来源的木糖异构酶在酿酒酵母中均没有得到活性表达［5］，直到1996年Walfridsson等［5］首次在酿酒酵母中实现了嗜热细菌Thermusthermophilus木糖异构酶的活性表达。但是，Walfridsson等［5］采用的是附加体载体系统，以单

6、倍体营养缺陷基因型的实验室菌株作为受体菌，外源基因在重组菌株中的表达稳性较差，不具备产业化意义。对工业生产菌株的代谢工程改造是工程菌产业化的前提条件，酿酒酵母生产菌株多倍性及野生基因型的状态，不能适用常规的分子生物学操作体系［8］。本文在建立了酿酒酵母工业菌株转化体系的基础上，以酿酒酵母酒精生产工业菌株NAN27为出发菌株，通过本实验室构建的整合载体pYMIKP，将T.thermophilus的木糖异构酶基因xylA以及同源木酮糖激酶基因XKS1，整合于NAN27染色体中，并对工程菌株木糖葡萄糖共发酵进行了初步研究。1材料与

7、方法1.1菌株和质粒EscherichiacoliDH5α（F-recA1endA1hsdR17［rK-mK-］supE44λ-thi-1gyrA96relA1）用于亚克隆。质粒pBXI［9］，用于克隆基因xylA的模板。酿酒酵母酒精生产工业菌株S.cerevisiaeNAN27（由河南天冠企业集团惠赠）为出发菌。pMAxy203为本实验室构建，携带在磷酸甘油激酶启动子终止子（PGKp.t）控制下的XKS1基因［9］，用于克隆PGKXKS1片段的模板。质粒pYMIKP为本实验室构建的酵母整合表达载体［10］，其选择标记为G

8、418抗性基因（Kanr），同时带有酿酒酵母的2.2kbrDNA片段，作为多拷贝整合位点。1.2培养基及培养条件E.coli在LB培养基中于37℃培养，添加50mg/ml氨苄青霉素用以筛选转化子。S.cerevisiae在YPD培养基中培养于30℃。在含有G41