实验四、双缩脲法测定蛋白质浓.ppt

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1、实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度N端C端相关知识目前常用的有五种经典方法：定氮法：灵敏度0.2~1.0mg双缩脲法（Biuret法）：1~20mgFolin－酚试剂法(Lowry法)：50~100μg紫外吸收法：5μg考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法(Kjedahl法)灵敏度低,适用于0.2~1.0mg氮,误差为2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用TCA沉淀蛋白质而分离)用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长双缩脲法(Biuret法)灵

2、敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100g快速5～10分钟各种蛋白质中的Tyr和Trp残基在280nm处的光吸收嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可校正Folin－酚试剂法(Lowry法)灵敏度高～5g慢速40～60分钟双缩脲反应;磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵;Tris缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝

3、法(Bradford法)灵敏度最高1～5g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化一、实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原理和使用方法。加热＋NH322H－180℃双缩脲2222二、实验原理双缩脲反应:碱性环境H2OO=CC=OHNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色络合物含有两个或两个以上肽键的化合

4、物均有双缩脲反应蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。在一定的实验条件下,未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540－560nm下比色,可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。除－CONH－有此反应外，－CONH2，－CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反应。三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器吸量管(1ml/2ml/5ml)、试管及试管架、分光光度计。（二）材料标准蛋白

5、溶液(10mg/mlBSA)、未知液(人血清×10)（三）试剂双缩脲试剂溶解0.175g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h，再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。四、实验操作步骤（一） 标准曲线的制作试管剂号012345标准蛋白溶液(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质浓度(mg/ml)02.04.06.08.010.0双缩脲试剂(ml)4.04.04.04.04.04.0

6、充分混匀后,室温下(20~25℃)放置30minA540（二） 绘制标准曲线以每管蛋白的含量为横坐标,其相对应的A520为纵坐标绘制标准曲线。（三）未知样品蛋白质浓度的测定取2只试管，每只分别加入1ml稀释的未知样品，再分别加入4ml双缩脲试剂，操作方法同前。然后，测540nm处光密度值，取其平均值。从绘制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。五、实验结果Y×N血清样品蛋白质含量=×100V其中：Y为标准曲线查得蛋白质浓度(mg/ml)N为稀释倍数V为血清样品所取的体积(ml)