转基因猪中蛋白高效表达的新途经.docx

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1、转基因猪中蛋白高效表达的新途经的研究摘要：如何使转基因动物中特定基因的蛋白高效表达一直是研究的热门，这里我们将描述一种新型的旁路蛋白表达途径，利用由睡美人转座子介导产生在两个种系的转基因猪中荧光蛋白表达。我们发现荧光蛋白的cDNA没有用于编码分泌途径的信号肽，且在先前的研究中，发现了转基因动物荧光蛋白定位在细胞质中。更重要的是，在哺乳期的母猪的乳汁样品中检测到了高含量具有生物活性的Venus或mCherry荧光。分析表明，这是由乳腺上皮细胞脱落进入乳汁中，这是第一次在牲畜乳汁中对报告荧光的描述，这极有可能改变现有的通过乳房产生重组蛋白的概念。关键词：转基因

2、猪睡美人转座子重组荧光蛋白引言：小鼠和很多牲畜的的乳腺已经成为当今大规模生产重组蛋白的生物反应器。一般来说，通过挤奶的方式获得转基因动物重组蛋白的方法最为常见。现今，通过这种方法，人类乳铁蛋白、α-乳清蛋白、酸性α-葡萄糖苷酶、白蛋白和溶菌酶都有了较高的产量。第一个转基因牲畜在1985年获得，在此之后，大量研究者进行了牲畜从组蛋白产生的研究，并且取得了很好的成果。其中包括，转基因猪生产的牛α-乳清蛋白，人类凝血因子Ⅷ，重组的人凝血因子IX和溶菌酶；转基因牛提升β和κ-酪蛋白、人乳铁蛋白的产量，转染色体牛用于生产人类抗体血清。转基因山羊被用来产生重组人类溶菌

3、酶，人类抗凝血酶III和重组丁酰胆碱酯酶；转基因绵羊用来表达产生人凝血因子IX；被用来表达类胰岛素因子Ⅰ，人类酸性α-葡萄糖苷酶的转基因兔也已经出现了。目前，转基因山羊和转基因兔产生第一批重组药用蛋白——重组抗凝血酶和C1酯酶被欧洲药物管理局（EMA）和美国食品药品监督局(FDA)批准上市。然而，在研究中发现，在一些转基因动物乳汁中，仅能检测到微量的重组蛋白。通常，乳腺中特异性启动子和调控元件，如酪蛋白、乳球蛋白和乳白蛋白启动子元件，在哺乳期内被用于靶向攻击在乳腺上皮细胞中重组蛋白的表达。从重组蛋白的产生到乳汁分泌需要氨基末端信号肽，使新生肽段进入内质网，

4、然后由高尔基体包装将成熟的蛋白质运送到分泌小泡中，与细胞膜融合并释放其中的蛋白到乳腺的内腔中。1.方法综述文章论述了一种不同的方法来使重组蛋白高效表达并且在乳汁中含量提升。之前，在不同种系的转基因猪中。采用睡美人转座子系统——分别使用荧光蛋白Venus和mCherry的cDNA构建报告转座子。两种报告转座子都是受驱动于普遍存在的活性嵌合巨细胞病毒（CMV）和鸡β-肌动蛋白启动子（CAGGS）。Venus和mCherry被设计成在胞浆内表达的重组蛋白。事实上，这一结果从对这些动物的器官、组织和细胞培养的分析中就已经证实了。通过分析哺乳期转座子母猪的乳汁，尽管

5、转基因构建体并未包括将重组蛋白分泌进入乳汁中关键因素的信号肽，但是结果表明，两个报告蛋白Venus和mCherry在乳汁中的含量都达到相当高的水平。此研究的结果可能会成为乳房产生具有生物活性蛋白的另一种方法。2.步骤简述1.分离乳样品和Westernblotting免疫印迹法2.荧光显微镜观察和图像处理3.乳和乳细胞样品凝胶过滤4.信号肽和糖基化位点预测5.糖基化检测3.结果与讨论3.1.结果3.1.1.Venus荧光蛋白在母猪乳汁中的表达通过生物信息学方法分析预测，在Venus和mCherry序列中，无分泌信号序列（图1），而对于现有的猪乳中蛋白有一个清

6、晰的信号肽序列，比如α-S1酪蛋白和β-酪蛋白，使用荧光显微镜可以准确的确认（图2）。乳汁样品来自2只转Venus的母猪和3只转mCherry的母猪，并且用5只非转基因猪作为对照。荧光显微镜图（图2）显示两个乳腺细胞和脱脂奶含有高浓度的Venus蛋白，通过对比显示出脱脂奶含有更高浓度的Venus蛋白，当然不排除Venus是由脂肪胶束途径分泌的可能性。由于没有信号肽共有序列，Venus蛋白并不是通过内质网分泌。一种可能是乳腺上皮脱落的细胞含有留在细胞质中的Venus蛋白进入到乳汁中。为了评估这种可能性，对脱脂奶和细胞组分进行了抗体-Venus和抗体-β微管蛋

7、白的免疫印迹测定，细胞骨架的β微管蛋白能被检测到，这表明在乳房腔内的乳腺细胞的某些成分因为膜受损进入乳汁中。3.1.2.mCherry荧光蛋白在乳汁中的表达水平对3个转mCherry的转基因猪乳分析，在乳腺细胞部分的mCherry是容易被观察的（图4），高mCherry的部分的颜色在白光照明下偏红。提取的乳腺细胞中的mCherry通过柱纯化和表达富集，通过与mCherry抗体的免疫印迹确认。但是，结果显示，初乳中检测不到mCherry报告蛋白，从第三天开始，mCherry在乳腺细胞中表达，然后在一个较高水平一直到断奶时间。在脱脂奶中，mCherry在第六天

8、可被检测到，然后一直存在直到断奶，但比在乳腺细胞中的水平要低。总的