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1、DNA提取方法的总结细菌DNA的提取：（一）试剂：1.抽提缓冲液2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl2.10MLiCl3.2MLiCl4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）5.3MNaAc(pH5.2)6.96%乙醇7.70%乙醇步骤：1.抽提缓冲液65℃预热；2.加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；3.加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm
2、，10min；4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；5.取上清，重复4步骤；6.加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C沉淀；11.离心12,000rpm，10min；12.弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。(二)（我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法）1.将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。3.沉淀物加
3、入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4.加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．真菌DNA的提取：（一）1.取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入
4、4mL提取液，快速振荡混匀3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）4.1000rpm，4℃，5min5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000rpm，4℃离心5min）6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30minulTE中m7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于5008.加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃
5、处理1hr9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）10.取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc（二）1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速
6、振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次3．加入1mL5MKAc，冰浴20min4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30minLm6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500TE中7．加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1hr8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rp
7、m，4℃离心5min）9．取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。以上是我们常用的方法．碱裂解法从大肠杆菌制备质粒为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓
8、度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制
