cell提蛋白过程改.doc

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1、Cell提蛋白过程1.提蛋白之前30min，先将冰盒或者冰块准备好，将裂解液RIPA（P0013B，碧云天）从-20℃冰箱取出溶化后，与蛋白酶抑制剂PMSF（ST506,碧云天）混合均匀，放在冰上。酶抑制剂的量(μl)/裂解液的量(μl)=1:1002.提蛋白时，先将培养基倒掉，用预冷的PBS洗两遍，根据培养瓶中细胞的量（若细胞比较大，即使铺满平底，细胞的数目也比较少；反之细胞很小，数目则多）加入裂解液约100到150ul或者更多，反应5到10分钟，均要放在冰上进行。3.将细胞刮下来，收集到预冷的EP管中，在摇床上振荡30分钟，至少10分钟，可每五分

2、钟吹打一下。4.先将离心机预冷4℃，把振荡好的EP管离心14000rpm，15到20分钟。5.吸上清液到预冷的EP管中，放于冰上即可，BCA法检测蛋白的浓度。配平过程：1.按照BCA试剂盒（P0012，碧云天）说明书配标准蛋白，最终浓度为0.5mg/ml。2.按照说明书在多孔板中加样，其中第一列为标准蛋白，从第二列开始为待测样本，例如下表(单位均为μl)：序列12标准蛋白双蒸水BCA待测样本双蒸水BCAA020200218200B119200218200C218200218200D416200E812200F128200G164200H200200其

3、中标准蛋白相对应的浓度分别为0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5（单位：mg/ml）。BCA工作液配置方法见说明：A液：B液=50：13.37℃静置30min。4.酶标仪测定蛋白浓度（波长：562nm）。5.在EXCEL表格中计算,如下表：酶标仪所测标准蛋白浓度标准蛋白加样量酶标仪所测待测样本的OD值将C代入公式所得的值待测样本浓度（E=D/2）待测样本体积（根据最小浓度下的体积算其它样本体积）（=96*19.29144/E）裂解液体积（=总体积-F）上样缓冲液（=总体积/4）根据A、B两列数据绘制标准曲线：选中A、B两列

4、数据------图表向导------XY散点图------平滑线散点图------下一步------下一步------完成------单击曲线------右键------添加趋势线------类型，“线性”------选项，“显示公式”，“显示R平方值”------确定得到公式y=57.592x-7.7404R2=0.9858（R平方大于等于0.99公式可用），根据公式求出X=?，即蛋白浓度。1.如上表所示，待测样本1—8配平成为等体积等浓度。其中在最后一步加入上样缓冲液（5X）后应振荡混匀，煮沸5min。如不进行westernblotting则放入

5、-20℃保存。所提蛋白与上样缓冲液的比例为4:1