细胞组织裂解(提蛋白)方法.doc

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1、第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50mMTris-HCl(pH7.5)150mMNaCl5mMEDTA1%NP-401mMPMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000rpm离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8MCHAPS:4%DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研

2、磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。在裂解液中加IPGbuffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPGbuffer是载体两性电解质，IPGbuffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPGbuffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加

3、裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50ug/ul测595OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都

4、减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。培养细胞细胞培养于100mL/LFCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，40g/LCHAPS，65mmol/LDTT)，同时加入1mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，旋涡振荡，反复液氮快速冻融4次，加DnaseⅠ50mg/L和RnaseA25mg/L室温作用15min，4°C15000g离心1h，收集上

5、清液-80°C冻存备用，Bradford法测定蛋白浓度[17]．第四种方法哺乳动物组织一般采用机械分散法：1取脑组织称重，研钵预冷，边加液氮边研磨，至非常细小的干粉。20℃PBS洗剂组织碎片，4℃3000g离心5分钟，估算离心管底部沉淀物的体积。3在5倍组织体积预冷的悬浮缓冲液中迅速用镊子分开或用剪刀剪碎组织碎片（最好加用蛋白酶抑制剂），大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用剪子分开或用用剪刀剪碎.悬浮缓冲液：0.1mol/LNaCl0.01mol/LTrisCl(PH7.6)0.001mol/LEDTA(PH8.0)1ηg/mlAprotinin100

6、ηg/ml苯甲基磺酰氟（PMSF）4尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液。5样品置于沸水浴中加热10分钟。6采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切。以最大功率处理0.5—2分钟一般能有效将裂解液粘度降至可控水平。7室温10,000g将样品离心10分钟，取上清。8计算使用Western法检测靶蛋白所需样品量。在细胞总提取液中加入已知量的靶蛋白同时进行Westernblotting检测，可为分析未知样品提供阳性对照，并可精确估计采用所选抗体时该法的灵敏度。可否换成DNase1和RNaseA?可省去超声操作我也是一名初学者，我将要

7、做的是大鼠脑膜蛋白的抽提。我拿到的裂解液的配方如下:1%SDS40mMTris65mMDTT(现加）ddH2O而且在匀浆后，似乎还需要加入50ug/mlRNase和200ug/mlDNase,在4℃放置15min;15000离心1h.取上清。我想请诸位高手指点一下，上面的配方和步骤中有无欠妥之处。谢谢！你的配方较适合水溶性蛋白的提取。8M尿素的加入能使膜蛋白更多地溶解，现在很多文献提倡用7M尿素，2M硫脲提取膜蛋白。另外CHAPS、TritonX100、NP40等去垢剂的使用是否也要考虑？还有提取蛋白以后的下一步将做什么也很重要，如果是做IEF则最好不要用SDS，

8、这会影响等