谢德鑫实验四 可溶性糖的硅胶G薄层层析.doc

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1、实验四可溶性糖的硅胶G薄层层析生物技术1114谢德鑫1目的：1．1掌握薄层层析法的基本原理和方法。1．2掌握可溶性糖分离鉴定的原理和方法。1.3熟悉用蒽酮试剂对糖的定量测定方法。2原理：薄层层析(TLC)是吸附剂或支持剂均匀有效地涂布在薄层上进行的层析，是一种微量而快速的层析方法。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附剂或支持剂中添加了合适的黏合剂后再涂布，可使薄层黏牢在玻璃板(或涤纶片基)这类基底上。硅胶G是一种添加了黏合剂的硅胶粉，约含12％～13％

2、的石膏，它可以把—些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层，使不同的物质得以分离，使用显色剂显色，得到不同的Rf值。糖在硅胶薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另—个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，用适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法测出各组分的含糖量。3仪器及材料及试剂3.1仪器：烘箱，吹风筒，喷雾器，分光光度

3、计，微量进样器，层析缸，点样毛细管。薄层玻璃板(20cmX20cm)，试管(15mLX24)。3.2材料及试剂：木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖标准溶液。糖标准溶液：取木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖各100mg，分别用75％乙醇定容至10mL，其质量浓度均为10mg／mL。层析溶剂：氯仿：甲醇=60：40（V／V)。苯胺—二苯胺—磷酸显色剂：1g二苯胺，苯胺1mL和85％磷酸5mL溶于50mL丙酮中。0.1mol／L硼酸溶液(H3BO3)，硅胶G粉。4操作步骤：4.1制备硅胶G薄层板：取硅胶G粉30g，加入75mL0

4、.1mol／L硼酸溶液中，调匀后铺于洁净、平整的玻璃板上，铺层后的薄板于100℃烘箱中烘干。取出后可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整，厚薄均匀。4.2糖在硅胶G薄层上的分离：选取制备好的薄层板一块，在距底边1．5cm的直线上选4个点，相互距离2cm。用毛细管分别点上不同的糖样品于4个点，点样量控制在5～10ug，边点样边吹干，斑点直径不超过3mm。待薄层板上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm处时取出薄板，前沿作一记号，于60℃烘干2～3h(

5、或空气中晾干)，挥发尽溶剂后用喷雾器均匀地喷上显色剂，于85℃烘烤10min，则各种糖分别显出不同的颜色。测量计算Rf值。5结果分析：记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值，绘出层析图谱进行分析。各种糖显色后的呈色如表所示；糖种类木糖葡萄糖果糖蔗糖呈色黄绿色灰蓝绿色棕红色蓝褐色图像如右图：戊糖（木糖）>己糖（葡萄糖）>双糖（蔗糖）>三糖（果糖）测量得到Rf（木糖）=