蛋白质的表达、分离、纯化实验流程.doc

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1、蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。实验步骤一：材料准备1.实验材料：大肠杆菌BL21、LB液体培养基、氨苄青霉素、WashingBuffer、ElutionBuffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2.实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2.获得目的基因①PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在

2、上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。②通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。3.构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。②PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。4.获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝

3、白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。③以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。5.氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。②按1:50或1:100的比例稀释过夜菌，一般转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培

4、养至OD600=0.6-0.8（最好0.6，大约需3h）。取10ul样品用于SDS-PAGE分析。③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，37℃继续培养1～3h。④12000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。6.氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化①NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。②重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品

5、60min，4℃12000rpm离心30min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS-PAGE分析。③上清样品以10～15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE分析。④洗脱杂蛋白：用WashingBuffer以10～15mL/h流速洗柱，直至OD280=0.01分步收集洗脱液，约3～4h，取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE分析。⑤洗脱目标蛋白：用ElutionBuffer洗柱，收集每1mL级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE分析。