蛋白质的分离纯化及实验技术

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1、第二章蛋白质的分离纯化第一节能用作纯化依据的蛋白质性质第二节蛋白质分离纯化的一般步骤第三节蛋白质的分离纯化方法分离纯化蛋白质的目的:①将蛋白质和非蛋白质杂质分离②将不同的蛋白质相互分离。分离提纯蛋白质的要求：（1）纯度（2）活性（3）得率（4）速度第一节能用作纯化依据的蛋白质性质1大小8密度2形状9配体结合能力3电荷10金属结合能力4等电点11可逆性缔合5电荷分布12特异性序列或结构6疏水性13非寻常性质7溶解度14基因工程构建的纯化标记1.大小蛋白质的大小各不相同，可从含几个氨基酸的小肽（几百个Da）至含10000

2、多个氨基酸（上百万个Da）的巨大蛋白质不等。多数蛋白质的分子量在10000—150000Da之间。2.形状蛋白质形状有近似球形的，也有很不对称的。在离心、凝胶过滤或凝胶电泳过程中都会受到形状的影响。3.电荷蛋白质的静电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷的总和。一蛋白质中，若天冬氨酸和谷氨酸残基占优势，在pH7.0时带净负电荷，则称之为酸性蛋白；若赖氨酸和精氨酸残基占优势，则认为是碱性蛋白质。4.等电点等电点（pI）是蛋白质上净电荷为零时的pH值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基数目和滴定曲线所决定。5.电荷分布电荷的氨基

3、酸可均匀地分布于蛋白质的表面，亦可成簇地分布，使某一区域带强的正电荷而另一区域带强负电荷。这种非随机的电荷分布可用来通过离子交换层析来分离蛋白质。6.疏水性多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些可见于表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分级分离的能力。7.溶解度蛋白质在不同溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（<10mg/ml)直至极易溶解（>300mg/ml)不等。影响蛋白质溶解度的因素包括pH、离子强度、离子的性质、温度和溶剂的极性。蛋白质

4、在其等电点处一般较不易溶解。8.密度多数蛋白质的密度在1.3—1.4g/cm3之间。分级分离蛋白质时一般不用这个性质。但是，在含有大量磷酸盐（如卵黄高磷蛋白，密度为1.8）或脂质部分（如脂蛋白，密度为1.03）的蛋白质，与一般蛋白质在密度上确有不同，可用密度梯度法将它们从大部分蛋白质中分离出来。9.配体结合能力有许多酶能相当紧地域底物、效应分子、辅助因子和DNA模板。可利用亲和层析分离10.金属结合能力有许多酶能与某些金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+)紧密结合。主要是其半胱氨酸或组氨酸残基可与

5、金属离子作用，可通过金属离子螯合柱将酶固定。11.可逆性缔合在某些溶液条件下，有一些酶能聚集成二聚体、四聚体等。如大肠杆菌RNA聚合酶在0.05mol/LNaCl溶液中形成二聚体，在0.3mol/LNaCl溶液中为单体，可利用这一性质，相继在不同条件下按大小进行分级分离。12.翻译后修饰许多蛋白质在合成后要通过加入糖基、酰基、磷酸基团或种种其他部分来进行修饰。这些修饰提供了可用于分级分离的依据。如糖蛋白能与含有外援凝集素的柱子结合，外源凝集素是一类能牢固地与某些糖基部分结合的分子。13.特异性序列或结构氨基酸残基在蛋白质

6、表面上的精确的几何表象可用来作为分离方法的基础。例如，常可得到只能识别蛋白质上的特定部位（表位）的抗体。把只能与待分离蛋白质结合的单特异性抗体连接于填料上，可制备成免疫亲和柱。14.非寻常性质除上述各种性质外，某些蛋白质还有一些不寻常的性质，如不寻常的热稳定性、抗蛋白酶解的抗性等。例如大肠杆菌碱性磷酸酯酶的纯化，将细胞提取物加热后离心去除凝结的蛋白质，然后用蛋白酶处理含有磷酸酯酶的上清液，该酶消化剩余的杂蛋白，留下基本纯净的碱性磷酸酯酶。15.基因工程构建的纯化标记随着基因工程技术的进步，克隆编码某一蛋白质的cDNA已变

7、得比较容易。通过改变cDNA而在被表达蛋白质的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的“标记”可用来作为一种有些的纯化依据。最通行的标记之一是在蛋白质的氨基端加上6—10个组氨酸，这样可以使肽链能与Ni2+螯合柱紧密结合，经洗脱，再用游离咪唑洗脱或通过将pH降至5.9，使组氨酸充分质子化，与Ni2+分离而使蛋白质得以纯化。第二节蛋白质分离纯化的一般步骤（一）前处理（二）粗分级（三）细分级动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织；种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱

8、脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。（一）前处理1、选材2、破碎3、混合物的分离（二）粗分级分离（1）盐析（2）等电点沉淀（3）有机溶剂分级分离（4）超滤（5）凝胶过滤（6)冷冻干燥（三）细分级分离结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结