从污水中提取大肠杆菌噬菌体的改良方法.doc

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1、从污水中提取大肠杆菌噬菌体的改良方法于艳游松孙非非(沈阳药科大学辽宁沈阳110016)【摘要】目的：改良从污水中提取大肠杆菌噬菌体的方法。方法：采用对大肠杆菌噬菌体敏感的大肠杆菌C3000菌株作为宿主菌，简化从污水中提取大肠杆菌噬菌体的操作。结果：方法改良后，可通过简单操作获得大肠杆菌噬菌体。结论：改良后的方法适用于一般实验室从污水中提取大肠杆菌噬菌体。【关键词】大肠杆菌C3000菌株；大肠杆菌噬菌体【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2016)19-0389-02Amodifiedmethodforisolationof

2、coliphagefromwastewaterYuYanYouSongSunFeifei(ShenyangPharmaceuticalUniversity10163)[Abstract]ObjectiveTomodifythemethodforisolationofcoliphagefromwastewater.MethodsSimplifiedoperationinisolationofcoliphagefromwastewaterbyusingE.coli(C3000)asahoststrain.ResultsThecoliphagecouldbere

3、generatedbysimpleoperation.ConclusionThemodifiedmethodiseasy,rapidandeffective.Itiscanbeusedundergenerallaboratorycondition.[Keywords]E.coli(C3000);coliphage新生牛血清作为细胞培养的重要基质，是生物制品生产过程中的重要原辅料。噬菌体在自然界中分布广泛，是新生牛血清最易污染的一类特异性病毒。美国FDA及《中国药典》中均规定新生牛血清需进行大肠杆菌噬菌体检查。由于噬菌体对寄生的宿主菌具有高度特异性，而污水中

4、常有肠道菌，故本法从污水中分离大肠杆菌噬菌体。本次试验所用宿主菌为对大肠杆菌噬菌体敏感的大肠杆菌C3000菌株。1.材料与方法1.1主要材料噬菌体来源：污水；宿主菌：大肠杆菌C3000菌株培养基：胰酪大豆琼脂培养基，胰酪大豆肉汤培养基；稀释液：0.9%氯化钠溶液试剂：40%甘油溶液1.2主要仪器L型涂布棒;冻存管;离心管(15mL>50mL)；薄膜过滤器(0.45um、0.22um)；生物安全柜；恒温培养箱；离心机。1.3实验方法1.3.1污水中大肠杆菌噬菌体的扩增将污水置30〜35°C恒温培养箱中培养18〜24h后，吸取2mL污水接种至100mL胰酪大豆

5、肉汤培养基中，置30〜35°C培养18〜24h。1.3.2大肠杆菌C3000菌株菌悬液制备取1支2代大肠杆菌C3000菌株在生物安全柜内打开，划线接种在胰酪大豆琼脂培养基上，置30〜35°C培养18〜24h后，用5mL已灭菌的0.9%氯化钠冲洗菌苔，制成菌悬液。1.3.3制备大肠杆菌噬菌体增殖液将1.3.1中污水样品经3000r/min,离心15min后，取上清液通过孔径为0.45um的薄膜滤菌器过滤。将滤液继续通过孔径为0.22um的薄膜过滤器过滤。取5mL滤液加入100mL胰酪大豆肉汤培养基中,同时加入1.3.2中大肠杆菌C3000菌悬液5ml,30~

6、35°C培养18〜24h。1.3.4制备噬菌体裂解液在上述混合培养的培养液中加几滴氯仿，3000r/min,离心15min,离心后的上清液依次经0.45um、0.22um薄膜过滤器过滤，获得噬菌体裂解液。取10mL裂解液，按5mL/支，加入100mL胰酪大豆肉汤培养基中，分别置20〜25°C、30〜35°C进行无菌检查，确认无菌生长。1.3.5大肠杆菌噬菌体侵染大肠杆菌C3000菌株试验按1.3.2中操作制备大肠杆菌C3000菌悬液，用L型涂布棒在胰酪大豆琼脂平皿表面涂布均匀，待菌液吸收后，将平皿置30〜35°C培养6ho取过滤后的噬菌体裂解液滴加于平板表

7、面，正立放置平皿，于30〜35°C温箱内培养24h后，确认平皿表面滴加滤液处是否出现透明无菌生长区。1.3.6大肠杆菌噬菌体的保存将经过确认无菌生长的大肠杆菌噬菌体滤液与灭菌40%甘油溶液按0.5mL/0.5mL装入冻存管中，低于-70°C保存。2.结果2.1噬菌体裂解液的无菌检查结果为无菌生长。表1噬菌体裂解液无菌检查试验*图中无色透明区域为大肠杆菌噬菌体侵染2.2大肠杆菌C3000菌株后形成的噬菌斑。3.讨论噬菌体具有体积微小，严格寄生等特性，大肠杆菌噬菌体作为阳性对照，在新生牛血清大肠杆菌噬菌体检查中至关重要。本次实验利用高敏的大肠杆菌C3000菌株

8、作为宿主菌，从污水中提取大肠杆菌噬菌体。污水来源广泛，本实验中所用