质谱在糖分析中的应用.doc

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1、质谱在糖分析中的应用100多年前德国著名科学家E.Fischer开始了糖的研究，1923M.Heidelber和T.Oswald提出细菌的抗原部分是多糖而不是蛋白质，因此，糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生。但是，糖类的研究远远落后于蛋白质和核酸研究，这主要是因为过去认为糖类在生物体内的主要作用是作为能量资源，例如动物体内储存的糖元和植物体内储存的淀粉，或者是作为结构材料，例如植物细胞的纤维素等，而旦，糖类的纯化处理和结构鉴定都较为困难。近来，由于对糖类的生物学功能有了新的认识,例如糖结合物在细胞识别、细胞间物质运输和对免疫功能的调节等方面的作用，同时由于多

2、糖以及糖结合物的分离、纯化、组分测定和结构分析有了长足的进步，因此关于糖类的研究又引起人们的重视。由于糖在生物学上的重要意义决定了其在医学领域有广阔的应用前景。现有的研究表明：一•些多糖有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白介素、抗体水平以增强免疫功能，有抗肿瘤（提高宿主免疫力和对肿瘤细胞呈细胞毒作用）、抗感染（提高宿主免疫力和直接杀菌、抗病毒作用，尤其在肝炎、风湿病和爱滋病上应用价值大）、抗消化性溃疡、降血糖、降血脂、抗血栓、抗辐射，抗毒物损伤、抗晕、祛痰镇咳、诱导干扰素的产生、促进血功能恢复以及促进蛋白质和核酸的生物合成等方面的生物活性。糖类化合物包括单糖及其衍生物、寡糖、

3、多糖、复合多糖和糖甘类。复合多糖包括糖蛋白和糖脂两大类。要阐明一种糖结构，必须了解：（1）分子量；（2）单糖残基实质；（3）单糖残基间的顺序；（4）单糖残基在糖甘键中的位置；⑸环状结构的类型；（6）糖甘键的构型。传统的化学和生化测定方法有酸水解、甲基化分析氧化裂解、酶解、碱解、旋光度测定及平均分子量测定等。近年来，核磁共振仪、X-射线衍射光谱、电子显微镜、激光拉曼光谱和红外光谱及GLC,TLC,HPLC,HPCE,超临界色谱（SFC）和亲和色谱等也都用于糖类分析。由于糖的组分复杂，结构相似，加之糖没有显色基团，难以不经衍生就进行光谱、色谱分析，故糖的分析难度较大，质谱

4、较为有效地克服了这一困难。1质谱在糖分析中的应用质谱对糖类化合物的分析开始于60年代，由于最初不能直接测定热不稳定的、不易挥发和极性强的生物大分子，所以糖化合物须进行衍生化。例如，多糖样品全甲基化保护羟基，水解得到部分甲基化的单糖混合物后，用硼氢化钠还原，再乙酰化得到部分甲基化链状多羟基醇的乙酰衍生物，应用GC-MS测定混合物，可了解单糖组成及大致的分枝情况。1.1快原子轰击电离质谱80年代初期质谱软电离技术如快原子轰击电离质谱（FAB-MS）和液态二次离子质谱（LSI-MS）的出现使糖的分析有了很大的进展。其原理为，一束高能粒子，如氯、林原子，射向存在于液态基质中的

5、样品分子而得到样品离子，这样可以得到提供分子量信息的准分了离子峰和提供化合物结构信息的碎片峰。测定寡糖样品时，FAB-MS的典型灵敏度为1nmol样品/uL基质，少于核磁所需样品的百分之—,并可以比EI和CI-MS提供更多的序列信息。Peter-Katalinic等测定了1〜10nmol含有25个糖残基的天然及衍生的糖磷脂的序列。Reinhold等分析了全甲基化和全乙酰化的寡糖和糖肽，这些化合物的分子量为5000〜15000uo寡糖还原端的衍生方法的发展使LST-MS可以更好的分离pmol量级的糖混合物。最近，Lacko等用FAB-MS测定了重组人体血浆中LCAT的N

6、-连接糖结构。1.2电喷雾质谱1985年，Fenn等首先报道了大气压电喷雾（EST）质谱系统，其电喷雾的过程如下：（I）喷雾器顶端施加一■个电场给微滴提供净电荷；（2）在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；⑶荷电微滴中溶剂的蒸发；⑷微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加热至200〜250°C,可使喷雾效率提高。该方法已被证明是研究糖结构的一种非常有效的分析方法。FAB-MS可以显示碎片离子，但只能产生单电荷离子，因此不适用于分析分子量超过分析器质量范围的分子。ESI可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m/z值。此外还

7、可产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。此外，ESI-MS可以补充或增强由FAB获得的信息，即使是小分子也是如此。那些因没有分子离子或只有nmol量级而不能用FAB检测的大分子寡糖，即使样品只有pmol量级旦未经衍生，也可以使用EST分。因此,EST-MS成为当前分析大分子糖及复合物的最好方法之一。Garozzo等使用负离子ESI-MS识别了毗喃葡萄糖的B1位与葡萄糖的C-2,-3,-4以及-6连接形成的不同二糖。Mulroney等将此方法扩展到异头物分析。Yoshimi等用IIPLC和EST-MS对不同阶段小鼠