细胞免疫组化常用试剂配制.doc

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1、免疫细胞化学常用试剂一、固定剂　　大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。　　目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读

2、者选用。　　1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　　40g　　0.1mol/L磷酸缓冲液　　　　　　　　至1000ml　　配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml0.1mol/L磷酸缓冲液（PhosphateBuffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1nNaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。　　该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定

3、取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。　　2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠　　试剂：A液：多聚甲醛　　　　40g　　蒸馏水　　　　　　　　　　400ml　　B液：Na2HPO4·2H2O　　　　16.88g　　蒸馏水　　　　　　　　　　300ml　　C液：NaOH　　　　　　　　　3.86g　　蒸馏水　　　　　　　　　　200m　　配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和

4、C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1nNaOH或1NHCl将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。　　该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。　　3．Bouin’s液及改良Bouin’s液　　试剂：饱和苦味酸　　40%甲醛　　　　　250ml　　冰醋酸　　　　　　50ml　　配制方法：先将饱苦味酸过

5、滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。　　该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。　　4．Zamboni’s(Stefanini’s)液　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　20g　　饱和苦味酸　　　　　　　　　　150ml　　Karasson-Schwlt’sPB　　　

6、　　至1000ml　　配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’sPB至1000ml充分混合（Karasson–Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。　　该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。　　5．PLP液　　P

7、LP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hydefixative）　　试剂：过碘酸钠　　赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：　　多聚甲醛　　蒸馏水　　配制方法：　　（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/lNa3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰

8、箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOsmmol/L/kg。　　（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后4℃冰箱保存。　　（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘