第5章体外分析技术ppt课件.ppt

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1、第5章体外分析技术待测物质浓度与检测手段临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析治疗药物甲状腺激素生殖激素过敏素癌症标志物感染性疾病维生素血清蛋白常量微量超微量现代医学的发展疾病诊断的革新可在没有任何临床症状，而病人体内发生1.基因表达异常；2.受体分布异常或受体功能改变；3.器官代谢异常；4.激素水平异常酶、神经递质……等异常，可早期发现。体外分析和影像学的发展起了很大作用例如癌症的早期诊断Berson&Yalow1960年美国的Berson和Yalow将核技术与免疫学技术结合建立了放射免疫分

2、析法。首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了NobelPrize。YalowBersonHistoryreviewRadioimmunoassay放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特异性开创了医学生物学超微量分析方法使人体内微量生物活性物质的测量成为可能对现代医学的发展起到推动作用R：放射性核素标记抗原高灵敏（10-9~-15g/ml）探测待测物上的标记信号(标记物的放大效应)I：免疫学反应高特异以抗体为结合剂B:标记抗原与非标记抗原竞争与同种抗体结合定义体外分析技术是以放射核素标记（或

3、其他非放射性标记）的配体为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。体外分析技术定量手段放射性测量技术酶定量技术化学发光定量技术生物学基础特异性结合反应：抗原-抗体的免疫结合反应；配基-受体的结合反应；底物-催化酶之间的酶促反应；结合体：抗原--抗体激素--激素结合球蛋白受体--配体体外分析技术体外放射分析体外非放射分析放射性竞争结合分析放射性非竞争结合分析放射免疫分析(RIA

4、)免疫放射分析酶免疫分析化学发光免疫分析荧光免疫分析(IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。放射免疫分析法在体外条件下,利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag量的一种超微

5、量分析技术。基本原理Ag-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+*Ag(B)(F)*Ag与Ag免疫活性相同*Ag＋Ag>AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,AgAb>*AgAbAg<*Ag,AgAb<*AgAbAg*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++Ag2550100200400800定量*Ag定量AbB%=B/(B+F)B1%B2%B3%B4%B5%B6%123456浓度+B%标准曲线常用的有B%（B/B+F)，B/F，F/B，B0/B等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的

6、反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。操作基本步骤加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。测量：测量游离或结合物部分的放射性。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。基本方法基本试剂1.抗体2.标记抗原3.非标记标准抗原（标准品）2.标记抗原1）比活度和放化纯度足够高比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg）放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放

7、射性的百分数。>90%2）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I放射免疫技术－常用的放射性核素125I3H射线γβ理化性活泼差核素丰度>90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应放射免疫技术－标记物制备125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶

8、电泳高效液相色谱法聚合、