专题五血红蛋白的分离和提取ppt课件.ppt

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1、课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离（一）凝胶色谱法（分配色谱法）

2、2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。原理：当不同的蛋白质通过凝

3、胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示（二）缓冲溶液(洗脱剂)1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制:.调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围

4、内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电

5、极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电

6、荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。2.原理：SDS

7、能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场

8、上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定