酶工程第九章酶分子修饰ppt课件.ppt

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1、酶分子修饰ModificationofEnzymeMolecule限制酶大规模应用的原因1.易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；2.容易受产物和抑制剂的抑制；3.底物不溶于水，或酶的米氏常数过高；4.酶做为药物在体内的半衰期较短；5.已知酶种类及产物有限。1.通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。——蛋白质水平2.通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。——核酸水平改变酶特性的两种主要方法酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的催化特性的技术。知识回顾：酶的活性中心酶分子修饰的目的酶分子修饰的种类修饰酶的化学性质酶分子修饰的应用主

2、要内容一、活性中心的概念酶分子中的一小部分区域——由酶分子中少数氨基酸残基参与组成与底物发生结合和催化作用与酶活力直接相关第一节酶的活性中心（activecenter）二、酶活性中心的共性1.酶的活性中心是由必需基团(essentialgroup)构成的与酶催化活性有关的特定区域，其构象不是固定不变的（诱导契合）。Theactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.酶分子非必需基团必需基团活性中心必需基

3、团活性中心外必需基团结合基团催化基团非活性中心活性中心7种氨基酸出现的频率最高:Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Ser某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基和羟基）是酶的必需基团。活性中心的重要化学基团半胱氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸天冬氨酸赖氨酸酪氨酸2.活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。3.活性部位是一个三维实体。Theactivesiteisoftenacleftorcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.4.活性中心位于酶

4、分子表面的疏水性裂缝中。5.酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。1.物理学方法2.化学修饰法3.动力学参数法4.蛋白质工程三、研究酶活性中心的方法用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。1.物理学方法2.化学修饰法根据所用修饰试剂不同，分为:1)非专一性化学修饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若修饰后：酶活性不变——修饰基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失——修饰基团可能是酶的必需基团，但不能确定是否同活性中心内的必需基团结合。2)专一性化学修饰基团专一性修饰用专一性化学修饰剂修饰酶分子中的某一特定氨基

5、酸残基的侧链基团。位点专一性修饰(亲和标记）利用酶对底物的特殊亲和力修饰酶分子活性中心的某一特定氨基酸残基的侧链基团。亲和修饰剂：①与底物结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。亲和标记（位点专一性修饰）化学修饰的专一性3.动力学参数法pH-酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需基团的pK值，通过比较分析估计基团的种类。4.蛋白质工程将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。一、酶分子修饰的目

6、的1.研究酶的结构与功能的关系（上世纪50年代）探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测第二节酶分子修饰的目的和原理2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围（上世纪70年代）1.提高酶的生物活性（酶活力）2.增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）3.消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）4.产生新的催化能力第三节酶分子修饰的种类一、金属离子置换修饰二、酶分子的化学修饰三、酶分子的物理修饰一、金属离子置换修饰P136（

7、metalionsubstitutemodification）将酶分子中的金属离子置换为另一种金属离子，使其催化特性发生改变的修饰方法。1.方法：酶的分离纯化除去原有金属离子：加入金属螯合剂，去除螯合物加入置换离子2.作用：阐明金属离子对酶催化作用的影响提高酶的催化效率增强酶的稳定性改变酶的动力学特性1.酶的表面化学修饰（1）大分子结合修饰（2）侧链基团修饰（小分子修饰）（3）交联法（4）固定化修饰（共价结合法）2.酶分子内部修饰（1）肽链有限水解修饰（2）核苷酸链剪切修饰（3）