融合蛋白的纯化ppt课件.ppt

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1、融合蛋白的纯化1以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失

2、或断裂。2一、蛋白质分离纯化的一般程序1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；这也就是蛋白质分离纯化的前处理工作。当然如果我们要分析分离的蛋白质存在于细胞的外分泌物中的时候，就无需对生物组织进行破碎处理了，只需要用适当的缓冲溶液将蛋白质抽提出来就行。2.用离心法将细胞的亚细胞颗粒（如核、线粒体、微粒体或核糖体）及细胞碎片与溶液分开。3.应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来。4.进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开。5.在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻干粉。34蛋白质分离纯化中的注意事项：1.首先要建立一个方便灵敏的分析方法。2.分离步骤要尽可能少

3、3.尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性：包括六个方面5尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性▼要求分离流程相当快速，同时分离过程通常要保持在低温（4℃）条件下进行。▼尽量避免过度暴露于氧气中▼注意重金属离子对酶的失活作用▼避免一切过激因素（如过酸或过碱）对蛋白活性的影响▼提取液的浓度应维持在较高水平▲最后，还需要注意的是：有少数蛋白质需在高离子强度的极性介质中保持活性，因此还需要想提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO466蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高

4、，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。72、等电点沉淀法　　蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的

5、等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。83、低温有机溶剂沉淀法由于有机溶剂自由移动的离子较少，具有较低的介电常数，所以会使溶液的介电常数减小，从而增强偶极离子之间的静电引力，进而使蛋白分子集聚沉淀。另一方面，有机溶剂如果是水溶性的话，本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层（争夺水分子），也促使蛋白质分子脱水而沉淀。9（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1、透析与超滤　　透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。　　超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。2、凝

6、胶过滤法　　也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（agarosegel）。101112（三）根据蛋白质带电性质进行分离1、电泳法　　各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳。13原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholyt

7、es)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。14两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应