细胞培养基本技术全面知识普及.ppt

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1、细胞培养基本技术内容细胞培养的理论背景设备与器材准备、溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存、复苏与运送常见问题及对策细胞培养的概念20世纪初才创立的一种研究动物细胞行为的方法。细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的应用1.药物研究与开发(1)新药筛选(2)疫苗研究与开发(3)基因工程药物研究与开发(4)细胞工程药物研究与开发2.基础研究(1)药物作用机理(2)基因功能(3)疾病发生机

2、理3.生物制药(1)疫苗生产(2)基因工程药物生产(3)诊断用和药用单克隆抗体生产(4)细胞工程药物生产细胞培养的应用细胞培养的优点1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段可控制调节条件：物理、化学、生物等因素可采用各种研究技术、记录方法：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等。3.样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。4.经济、规模和机械化细胞培养的局限性人工模拟体内

3、环境的技术已经很高,但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中，必然发生变化。概念：原代与传代原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的生长方式贴壁生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体组织来源细胞、上皮细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿

4、瘤细胞。贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞悬浮细胞细胞培养的环境1、无污染环境：化学污染、微生物污染2、温度环境：37℃。偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，3、气体环境：95%空气加5%二氧化碳4、酸度环境：大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，细胞耐酸性比耐碱性大一些。5、细胞培养基：合成培养基、天然培养基。细胞培养成功的关键1.实验材料的清洗、灭菌。2.无菌操作3.勤劳内容细胞培养的理论背景设备与器材准备、溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲

5、线冻存、复苏与运送常见问题及对策实验设备与器材CO2培养箱超净工作台倒置显微镜滤器电动移液器超纯水仪液氮罐培养瓶、培养皿实验器材的清洗和灭菌清洗的重要性1.除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等2.使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。不要让污染了的器皿变干！！灭菌的重要性除去微生物污染酸液配方新的玻璃器皿的清洗灭菌自来水刷洗，除去灰尘。烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。刷洗、烘干：泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。泡酸、清

6、洗：用酸液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次，最后蒸馏水冲洗3-5次。烘干、包装：移液管和滴管的尾端要塞入棉花。高压灭菌烘干备用使用后的玻璃器皿的清洗灭菌刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗10次（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），过蒸馏水3次。烘干、包装高压灭菌烘干备用金属器皿金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再

7、用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。橡胶和塑料刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。泡入5％盐酸过夜。自来水冲洗10次，过蒸馏水3次烘干高压蒸汽灭菌烘干备用滴管胶头可用75％酒精浸泡5分钟，紫外线照射消毒。水、溶液、培养基水：超纯水。至少为三蒸水或去离子水。需配制的溶液平衡盐溶液（PBS或D-Hank’s等）胰酶培养基溶液除菌方式高压蒸汽灭菌：平衡盐溶液过滤除菌：不能高压的溶液，如培养基、胰酶等培养基培养基（培养液

8、）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。