液相色谱的分离机理及色谱柱.说课材料.ppt

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1、液相色谱的分离机理及色谱柱.极性问题液相色谱的分离机理正相反相体积排除离子交换其他不同的分离模式是不同的机理吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相∶非极性有机溶剂，如己烷乙酸等为添加剂常用固定相∶硅胶、氧化铝等。分配色谱的分离机理分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相

2、多为键合相?键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同体积排除色谱的分离机理凝胶色谱概述凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）分离基于分子在溶液中的体积大小洗脱次序：大分子先被洗脱流动相不参与分离，只起溶剂作用分离效率低色谱行为容易预测GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离液相色谱柱及分离机理的关系从色谱方法上分正相/反相离子交换分子体积排除亲合从柱子类型上分分配/吸附离子交换凝胶亲合

3、液相色谱的方法开发（二）梯度方法梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式柱需再生定量分析的重复性较低如不用梯度：分离不理想梯度条件的优化检测器对检测器的要求高灵敏度可重现的设置合适的带宽快速或可变的时间常数宽的线性响应容易使用及保养自我诊断功能检测器的种类衡量检测器的指标灵敏度∶S=△R/△Q△R是检测器响应值的增量△Q是样品量的增量噪音∶没有样品时检测器的最大输出信号漂移∶检测器在一段时间内响应值的变化线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度信噪比∶S/N注意∶最小检测

4、限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此紫外-可见光检测器基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊)Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透过溶剂的光能量P=透过样品的光能量光通量(透过率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=单位吸光度×流动池长度×溶液浓度即∶A=abc同紫外检测器灵敏度有关的因素信号强度(S)从BEER定律可看出样品的种类样品浓度及进样的体积检测池的长度所使用的波长，检测器的时间

5、常数噪音(N)流动相所使用的波长，灯的能量检测器的时间常数非检测器因素-电噪音，泵脉动等紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长溶剂的质量好坏对其截止波长有影响为何溶剂质量不好?含紫外吸收的杂质溶解在其中的氧气缓冲液溶质的紫外吸收示差折光检测器DifferentialRefractiveIndexDetector示差检测器的注意事项不能做梯度实验最大的池耐压是100psi流速范围是0.3-10ml/min.液相色谱的定性及定量技术色谱峰定性鉴别每个色谱峰通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间

6、相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性用“标样”的保留值定出被测组份的位置进一步的确认标准加入同时用其他方法其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）其他检测器PDA，光谱图比较、谱库检索MS，质谱图解析、谱库检索其他仪器方法定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法痕量分析如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：分析前浓缩样品选择高灵敏度检测器用衍生法使色谱体系最

7、优化使用短的微径柱（减少样品的稀释）使用高效色谱柱使k'值尽可能小增加进样体积和浓度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗常用的定量方法峰面积百分比法由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用外标法在液相色谱中用的最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用的最多外标法定量配制一系列已知浓度的标样外标法定量（二）实际色谱图标准曲线外标法定量（三）计算公式特点无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（二）实际色谱图标准曲线内标法定量（三）计算公式：特点：无需各组份都被检出、洗