葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、教学文案.ppt

《葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、教学文案.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、分子生物学实验实验七：质粒的小量抽提实验八：质粒DNA的酶切及电泳鉴定实验九：聚合酶链式反应技术实验十：PCR产物的胶回收纯化实验十一：大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化实验十二：DNA的体外重组实验要求（1）实验前要预习相关的内容，弄懂原理，了解实验的设计思路，找出实验操作的关键步骤，试剂的配制方法及用量，数据处理的方法等。（2）实验过程中，要认真，规范的操作。学会安排实验时间和实验顺序。如实记录实验中出现的现象和数据。（3）使用仪器时要按照说明书去做。发现故障应停止使用。节约试剂。公用试剂用完后，要及时放回原处。（4）实验报告要及时完成。

2、报告上要注明实验日期及温度。在报告的结果讨中，对实验现象，结果和数据等可进行分析；也可对实验中遇到的问题及实验中需要改进的地方进行讨论。（5）一般试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水)配制，有特殊要求的除外。（6）试剂(特别是液体)一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥的药勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒的化学药品时应注意安全，必要时应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。（8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。成绩评定平时成绩：考勤实验技能测试和实验报告等50～60%期末理论考试：50～4

3、0%实验室：207室209室领用仪器：211室袁莉实验葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质张萍萍一.目的和要求1.掌握葡聚糖凝胶柱层析法的分离原理及基本操作技术:装柱平衡加样洗脱收集等步骤.2.了解VtVeVoViKdKav等参数的含义.二.原理凝胶层析（gelchromatography）又称为凝胶过滤（gelfiltration）、分子筛过滤（molecularsievefiltration）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。凝胶是由胶体粒子构成的立

4、体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于两者之间的分子，不完全渗入凝胶网眼，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。分子筛效应的理论A．小分子由于扩散作用进入

5、凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过；B．(1)蛋白质混合物上柱(2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻在颗粒之外（3）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开(4)大小分子完全分开(5)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。本实验利用凝胶柱：SephadexG-50柱层析，以水为洗脱液，分离大分子的蓝葡聚糖-2000（分子量200万）和小分子的重铬酸钾（分子量293）;根据组分的颜色深浅绘制洗脱曲线;并利用洗脱参数计算组分的分配系数。交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)这是由葡萄糖的多聚物与1–氯–2、3

6、–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)常以G–10至G–200号码标记G：反应凝胶的交联程度、膨胀程度等G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/1g干胶。市售有G–10、G–25、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。一般说SephadexG-l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。

7、SephadexG–75～200用以分离各类蛋白质。外水体积(Vo:outervolume)：指基质颗粒之间体积的总和.内水体积(vi:innervolume)：指基质颗粒内部体积的总和.基质体积(Vg)：指基质自身所具有的体积。V。、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。洗脱体积（Ve）：指自加样到组分出现最大浓度（峰）时所流出的洗脱液体积。床体积Vt（totalvolume)：指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。Vt是基质的外水体积(Vo)和内水体积(Vi)以及自身体