浮游植物叶绿素a4种提取方法比较

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1、浮游植物叶绿素a4种提取方法比较　　【摘要】目的优选地表水中浮游植物叶绿素a的提取方法。方法实验室制备发生水华的水样，分别选用丙酮研磨法、冻融法、丙酮加热法、混合溶剂法4种方法提取叶绿素a，进行叶绿素a含量的测定。结果冻融法、丙酮加热法、混合溶剂法对样品中叶绿素a的提取效果及方法精密度优于丙酮研磨法（P0.05）。结论丙酮加热法和混和溶剂法可为常用叶绿素a测量方法，尤其适用于大批量水环境样品的测定。【关键词】叶绿素a；提取；丙酮研磨法；混和溶剂法叶绿素a（chlorophylla）存在于所有植物中，是估算水体中浮游植物浓度的重要指标。近年来，由于中国水体富营养化问题日益严重，浮游植物叶绿素a的

2、测定备受关注。浮游植物叶绿素的测定方法根据测定仪器可分为高效液相色谱法（HPLC法）、荧光光度计法和分光光度计法等，但上述方法均不适用于快速、大量、野外样品的分析。目前国内浮游植物叶绿素a的常规测定方法存在测定结果偏低、耗时长、重复测定精密度差等特点，且在研磨过程中操作人员和丙酮接触时间长，不利于实验人员的健康。因此，人们通过改变细胞破碎方式、延长提取时间、增高提取液温度、改变提取溶剂等方法，对标准方法进行了优化改进。5本文选取丙酮研磨法、冻融法、丙酮加热法、混合溶剂提取法，以实验室培养的水华水样为实验对象，进行叶绿素a的测定研究。从叶绿素a的提取效果、重复操作精密度、操作的简便性和叶绿素a在

3、提取溶剂中的稳定性等几个方面对这4种测定方法进行比较，报告如下。1材料与方法1.1水样准备将实验室培养的藻种混合配置成实验水样，水样中含有硅藻属中的小环藻和菱形藻，绿藻属中的小球藻、栅藻、新月藻。水样配好后立即加入碳酸镁，每升样品加1%的碳酸镁1ml，以防止酸化引起的色素波长偏移。在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜，将水样摇匀后分成20份，每份250ml，分别抽滤浓缩，抽完后继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。将滤膜对折后，夹在滤纸内，套上黑塑料套，于-20℃条件下干燥过夜。1.2叶绿素a的提取1.2.1丙酮研磨法将冰冻过夜的滤膜取出剪碎放入研钵，加入少量碳酸镁粉末和90%丙酮10ml充分研磨（6

4、ml用于研磨，4ml用于润洗），将样品转移至10ml具塞离心管中，在4℃冰箱中避光浸提8～10h。1.2.2丙酮加热法将90%丙酮在控温水浴锅中预热（55℃）。将冰冻过夜的滤膜取出剪碎放入10ml具塞离心管中，加入上述预热的丙酮10ml，在55℃条件下水浴2min，5于4℃冰箱中避光浸提2h。1.2.3冻融法将过夜的滤膜取出剪碎放入10ml具塞离心管中，再放入-20℃冰箱中冷冻，每隔30min取出在室温中解冻10min，反复冻融3～5次后，离心管中加90%丙酮10ml，振摇1～2min后放入4℃冰箱避光浸提，每隔30min取出振摇1次，重复3次。在4℃冰箱中避光浸提20h。1.2.4混合溶剂法

5、将过夜的滤膜取出剪碎放入10ml具塞离心管中，加入混合提取液10ml（90%丙酮∶95%乙醇=2∶1；）在4℃冰箱中避光浸提8～10h。1.3比色测定浸提后将样品3500r/min离心15min，取上清液上分光光度计测定，分别以提取溶剂作为空白，用1cm光程的比色皿，读取750nm、630nm、663nm和645nm下的吸光度。2结果2.14种方法叶绿素a提取效果的比较见表1。2.2叶绿素a在不同提取液中稳定性的比较见表2。丙酮研磨法、冻融法、丙酮加热法的提取液均为90%丙酮，混合溶剂法的提取液为90%丙酮+95%乙醇。浸提液在4℃冰箱中避光放置0、3天后测定样品中叶绿素a含量，用来检验叶绿素

6、a在不同提取液中的稳定性。3讨论5从提取效果和方法精密度来看：冻融法、丙酮加热法、混合溶剂法测定叶绿素a含量结果及重复测定精密度均高于丙酮研磨法，前3者测定叶绿素a含量结果及重复测定精密度间差异无统计学意义。冻融法的提取效率在四种提取方法中最高，丙酮加热法的精密度较好。从操作耗时来看，丙酮加热法提取过程操作简单、耗时短，平均仅需2.5h，能够满足大量样品快速测定的要求。混和溶剂法和丙酮研磨法实验耗时相近，均为9h左右。冻融法耗时太长，需23h，无法满足快速大量测定的要求。冻融法对藻类叶绿素的提取通过两方面来完成，一是滤膜在-20℃下冰冻，再在室温条件下融解，利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增

7、高引起溶涨[1]，使胞壁结构破碎引起叶绿素溶出；另一方面考虑到反复冻融对藻类细胞的破壁率受到细胞种类、同种藻类不同生长状况的影响[2]，因此需采用延长浸提时间来提高提取效率。叶绿素a测定时要求A（750nm）应小于0.005。上述4种提取方法的A（750nm）均值均小于0.005，但冻融法、丙酮加热法、混合溶剂和溶剂法的A（750nm）均低于丙酮研磨法，且较稳定。从叶绿素a在提取液中稳定性来看，叶