超分辨荧光显微技术原理.docx

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1、2014年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注StefanHell、EricBetzig二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1.为什么需要（光学）显微技术？ 2.为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3.用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”为什么这个理论极限可以被突破？ 5.为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场

2、（透射光）显微技术？ 1.采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为5微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即10微米。再结合眼

3、球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛25厘米的位置，我们能分辨物体上相距为80微米的两个点，换算成点阵密度就是大约320ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。 如果要观察小于80微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。 按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为200纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的sCMOS相机（每个感光像素尺寸为微米），只

4、需要使用放大倍率为65倍的物镜就足够了。 那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于200纳米的物体，比如细胞里面微管呢？ 答案是不可以。 2.光学衍射极限 由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。 图1.光学显微镜简化示意图 如上面的简图所示，紫色箭头表示的物体PQ经过物镜等之后在相机上成像为P'Q'。由于光的衍射，物体上的点如P、Q，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑（或称艾里斑），如右侧的同心圆所示。那么，当P'、Q'相距太近的时候，两个斑会叠加导致难以分辨。这就要求物体上的P、Q要相距一定的距离

5、。 1873年，德国物理学家、卡尔蔡司公司的恩斯特·阿贝（ErnstAbbe）首次推算出衍射导致的分辨率极限。根据瑞利判据——“当一个像斑的中心落到另一个像斑的边缘时，就算这两个像刚好能被分辨”，显微镜能分辨的物体上两点P、Q的最小距离h为： 这个公式就是光学显微镜的分辨率公式，或称为光学衍射极限。（注意此处的分辨率与通常说的显示器分辨率含义不同） 其中，为光的波长，n为物方的折射率，为物体与物镜边缘连线和光轴的夹角。如上图所示。为方便起见，其中的通常称为数值孔径，简写为NA。 摄影领域常用f/#或称光圈值来描述镜头，光圈值与数值孔径可以相

6、互换算。对于一枚光圈为的镜头来说，数值孔径为，其分辨能力约微米。 目前常用的高倍物镜NA最大为，可以算出，对于可见光，比如波长500纳米的绿光，显微镜的分辨率约为200纳米。所以，即使再提高物镜的放大倍率，也不能提高显微镜的分辨率。 而200纳米这个数值也就通常被称作衍射极限。 .光学衍射极限的动态范围 从上面的公式可以看到，光学衍射极限其实并不是一个具体的数值，如果改变上述公式中的参数，是可以有效提高分辨率的。 (1)光的波长 可见光波长范围是400~760nm，如果使用更短波长的光，比如紫外线，理论上可以提高分辨率。但是紫外线能量高，易损伤

7、样品，而且透射能力低，很难透过物镜。人们想到了使用高能电子束代替光束，比如200keV的电子对应的的布罗意波长为纳米（*米）。虽然NA相对较小（约为10°），依然可以达到纳米的理论分辨率。这就是电子显微镜的基本原理。 严格的说，电镜的分辨率依然限制在光学衍射极限的范围内。只不过这里的“光学”是“电子光学”。 (2)物方折射率n 空气折射率为1，水的折射率，玻璃折射率。目前主要的物镜都是玻璃材质，并在物镜与样品之间用与玻璃折射率一致的油来浸润，以提高分辨率。 2012年Olympus发布了一款NA高达的物镜，光学部分使用蓝宝石（折射率约）制作，并搭

8、配高折射率的镜油（目测成分应该是二碘甲烷Methyleneiodide）。 也许在未来能发明