植物氨态氮测定.doc

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1、植物组织氨基酸含量的测定（改良的茚三酮比色法）一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。根据蓝紫色的深浅，在580nm波长下测定吸光值。本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不稳定性。二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、

2、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计三、试剂1.10%醋酸(100mL)2.1%抗坏血酸（100mL）3.5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至1000mL）4.pH5.4醋酸缓冲液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀释至1000mL）加41.2mL0.2mol/L醋酸钠（醋酸钠16.4g或三水醋酸钠27.2g配成1000mL）。5.水合茚三酮试剂：1.1g茚三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇，摇匀，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀，再加9mLpH5.4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限10天。四、操作步骤1.标

3、准曲线的绘制以下表所示量从5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL，对照仅加2mL蒸馏水，后在各试管中加入3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，在波长580nm处测吸光值，以氨态氮浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。试管号1234567试剂（mL）00.20.40.81.21.61.8氨态氮浓度00.512345（μg/mL）2.称取0.5g新鲜植物材料，放入研钵中，加入5mL10%醋酸，研磨后以蒸馏水稀释至100mL，混匀，

4、通过滤纸过滤，弃去最先滤下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。3.从剩下的滤液中取2mL放入试管中，加3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馏水代替）的试管加热。2.取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色，茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，混匀。在波长580nm处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公式计算氨态氮含量。（10-6×100×C）X（100g样品中的氨态氮毫克数）=×100nC：比色液中氨态氮浓度（μg/

5、mL）n：样品重量（g）100：分析溶液总体积（mL）5.实验结果与分析氨态氮含量标曲：序号1234567氨态氮浓度00.512345OD值0.1520.2370.3180.4150.4840.6070.718方程：y=0.1073X+0.181测定样品液的OD580值为：0.939标曲查得：0.939=0.1073C-0.181C=10.38μg/mL（0.1×10×10.38μg/mL）X（100g样品中的氨态氮毫克数）=×100=10.38mg/100g（2×0.5）故：该植物中氨态氮的含量为10.38mg/100g。