GBT 18637-2002 牛病毒性腹泻 粘膜病诊断技术

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1、GB/T18637--2002前台牛病毒性腹泻/粘膜病(bovineviraldiarrhea/mucosaldisease>BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV玛}起的牛的一种以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的疾病应用微量血清中和试验检查BVD/MD抗体，具有其特殊意义，它不仅可以定性，而且还可以定量，并从抗体量的动态变化中，可以判定病牛是以前感染过本病，还是现在正在感染过程中，从而为防治本病提供科学依据本标准的附录A、附录B、附录c都是标准的附录本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国兽药监察所、农业部动物检疫所。本

2、标准主要起草人:邵振华、郑志刚中华人民共和国国家标准GB/T18637--2002牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术Diagnostictechniquesforbovineviraldiarrhea/mucosaldisease范围本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)的诊断技术要求。本标准适用于BVD/MD的流行病学调查和检疫。2定义本标准采用下列定义。细胞玻片放置在莱顿氏(Lei沙ton's)管或其他用作培养细胞的小瓶中，长有单层细胞的盖玻片。3BVD/MD病毒分离与鉴定3.1材料准备3.1.1阳性参照毒株为牛粘膜病病毒俄勒冈毒株(OregonC,,V)o3.1.2BVD/M

3、D荧光抗体(BVD/MD-FA)、阳性血清。3.1.3荧光显微镜:采用蓝紫光为激发光的透射式或落射式荧光显微镜3.1.4犊牛(或胎牛)血清:无BVD/MD抗体和无污染。3.1.5细胞培养瓶扁瓶、Leighton's管、0.17mm厚度的盖玻片(1.0cmX3.8cm或0.8cmx2.4cm),0.8mm-1.0mm厚的普通玻璃载片，带盖湿盒。3.1.6溶液配制:pH7.0^-7.20.01mol/1,磷酸盐缓冲液，pH9.0^-9.50.5mol/I碳酸缓冲甘油〔见附录A(标准的附录)〕31.7细胞培养液:见附录B(标准的附录)。3.1.8原代细胞培养物:见附录C(标准的附录)。3.2

4、病毒分离3.2.1样品的采集32.1.1对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。3.2.1.2对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采血或鼻分泌物。3.2.1.3对流产、死胎，采胎儿的组织。3.2.1.4对怀疑为死于粘膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已发生白溶，可采扁桃体或淋巴结。3.2.2样品处理3.2.2.1血液用常规方法分离血清。3.2-2.2凝血块:冻融数次后，取析出的上清液(加人适量的双抗即青链霉素)。3.2.2.3组织样品用含1000IU/m工双抗的细胞培养液作1:10倍的乳剂，离心取上清液中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02

5、-19批准2002-05-01实施Gs/'r18637--20023.2-2.4精液冻融3次(或超声波裂解处理)，用细胞培养液作1:10倍稀释，离心取上清液32.2.5鼻分泌物:用含1000IU(mg)/mL双抗，)的培养液4倍稀释后，离心取上清液。以上各样品处理后均需作无菌检验3.2.3样品的接种培养3.2.3.1将10ml牛辜丸原代细胞(见附录C)接种于小扁瓶，置37C静止培养。培养到细胞形成80Y以上单层。3.2.3.2取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培养液，接种3.2.2.1~3.2.2.5的样品，每瓶接种样品1mL.每份样品接种3瓶。3.2-3.3置37(、吸附2h-3ho3

6、.2-3.4吸附后，将样品倒去，加维持液[见附录B中BI，另加3%犊牛血清(3.1.4)]10m工置37C恒温培养32.3.5培养6d后，将其冻融3次，收集3瓶细胞及其培养基，混合后即为样品分离细胞培养物3.3样品分离物的病毒鉴定3.3.1分离物的细胞玻片培养33.11将1ml牛肇丸原代细胞悬液，接种于带盖玻片((3.l.5)的Leighton's管，置37C培养，至盖玻片L细胞生长成80%的单层33.1.2取3.3.1.1中4个工eighton's管，倒去培养液，每瓶接种3.2.3.5中样品分离细胞培养物1ml。33.1.3置37C吸附2h一3h.3.3.1.4吸附后，加维持液1mL

7、.置37C恒温培养3de33.1.5取出细胞玻片、用磷酸盐缓冲液(见附录A中A1)轻轻漂洗，倾去液体，自然干燥。用纯丙酮室温固定10min一15min3.3.1.6取各组固定后的细胞玻片(样品组取半数，余者在必要时作抑制染色试验用)，置湿盒内，细胞面向上，滴加BVD/MD-FA(3.1.2)，并使免疫荧光抗体(FA)铺满而又不溢出于细胞面。将湿盒盖盖严，置37C染色2h。随后取出，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，倾去液体。3.3-1.7封片:将细胞面向