SNT1129-2007-牛病毒性腹泻粘膜病检疫.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１２９—２００７代替ＳＮ／Ｔ１１２９．１～１１２９．２—２００２牛病毒性腹泻／粘膜病检疫规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫狅狏犻狀犲狏犻狉犪犾犱犻犪狉狉犺犲犪／犿狌犮狅狊犪犾犱犻狊犲犪狊犲２００７０８０６发布２００８０３０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１１２９—２００７前言本标准代替ＳＮ／Ｔ１１２９．１—２００２《牛病毒性腹泻／粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１２９．２—２００２《牛病毒性腹泻／粘膜病病毒分离操作规程》。本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由

2、国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、张体银、袁文泽、简中友、董志珍、霍蕾。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１２９．１—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１２９．２—２００２。Ⅰ犛犖／犜１１２９—２００７牛病毒性腹泻／粘膜病检疫规范１范围本标准规定了牛病毒性腹泻检疫规范。本标准适用于牛病毒性腹泻的病毒分离鉴定、病毒抗原检测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。２规范性引用文件下列文

3、件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３疾病概述牛病毒性腹泻（ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａ，ＢＶＤ）是由牛病毒性腹泻病毒（ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，ＢＶＤＶ）引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、致畸或新生犊牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高

4、而死亡率低。粘膜病（ＭｕｃｏｓａｌＤｉｓｅａｓｅ，ＭＤ）也是由ＢＶＤＶ引起的一种以牛的急性型口腔、消化道粘膜发炎、糜烂、溃疡为特征的传染病。它和牛病毒性腹泻是同一病原引起，但表现不同的临床症状，发病动物口腔，特别是沿齿龈边沿糜烂，还可出现流泪和大量流涎。该病传染性不高，临床症状明显，发病率低，而死亡率很高。其病原、流行病学、症状、发病机理和病理变化、检疫及诊断参见附录Ａ。４检疫方法４．１病毒分离和鉴定４．１．１仪器试剂４．１．１．１倒置荧光显微镜。４．１．１．２二氧化碳培养箱。４．１．１．３１０ｍＬ标准细胞培养瓶，２４孔平底细胞培养板，带盖湿盒。４．１．１．４无ＢＶＤ抗体胎

5、牛血清，细胞分散液。４．１．１．５ＢＶＤ标准毒株（ＯｒｅｇｏｎＣ２４或ＮＡＤＬ）和标准阳性血清，ＢＶＤ荧光抗体，ＢＶＤ酶标抗体。４．１．１．６细胞：使用ＭＤＢＫ细胞或三代以内未感染ＢＶＤ病毒的胎牛肾细胞（ＢＫ）。４．１．１．７溶液及细胞培养液：配制参见附录Ｂ。４．１．２样品的采集４．１．２．１对于牛群、种牛的检疫，应无菌采集血液或者精液。４．１．２．２对于怀疑为死于病毒性腹泻的牛，应采集血凝块和肠系膜淋巴结。４．１．２．３对于流产、死胎牛的检疫，应采集胎儿的组织。４．１．３样品的处理４．１．３．１血液用常规方法分离血清，血凝块应冻融３次后，取析出的上清液。４．１．３．２精液

6、冻融３次（或超声波裂解）后，按规定稀释，离心取上清液。４．１．３．３动物组织加１０倍体积含有１０００ＩＵ／ｍＬ双抗的细胞培养液研磨，离心取上清液。１犛犖／犜１１２９—２００７４．１．４样品的培养４．１．４．１取生长良好，形成８０％以上单层的ＭＤＢＫ细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种１ｍＬ，每个样品接种３个细胞瓶，同时直接接种样品稀释液作为阴性对照。４．１．４．２置３７℃二氧化碳培养箱吸附３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ。４．１．４．３倒去样品，加入维持液，３７℃二氧化碳培养箱培养６ｄ。４．１．４．４收获病毒，同一样品３瓶混合，放至－２０℃冻融３次后进行下一步鉴定。４．１．５

7、荧光抗体法鉴定５个／ｍＬ的细胞悬液，加入２４孔细胞４．１．５．１将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０培养板内，每孔０．８ｍＬ，置３７℃培养。４．１．５．２待细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔４００μＬ，每个样品４个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物。４．１．５．３置３７℃二氧化碳培养箱吸附３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ。４．１．５．４吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔０．８ｍＬ，置３７℃二氧化碳培养箱培养３ｄ。４．１．５．５弃掉２４孔培养板内的培养液，用