第二讲 正常和肿瘤组织细胞的培养(200910).ppt

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1、第二讲正常和肿瘤组织细胞培养温州医学院检验医学院陶志华内容正常组织细胞培养上皮细胞的体外培养血管内皮细胞的体外培养肾小管上皮细胞的培养巨噬细胞的培养淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养上皮组织的体外培养上皮细胞的基本特征：1.上皮组织的形态结构群体依赖性（populationdependence)接触抑制（contactinhibition)2.上皮细胞的极性贴壁依赖性细胞-贴壁生长生长基质3.上皮细胞间的连接体外培养的上皮组织细胞的生长生物学1.形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显2.体外培养上皮组织的生长与增殖特

2、征(1)体外培养的特殊条件：a.防范微生物污染b.生长基质的基质c.特殊的培养基M199RPMI1640DMEMFamF12无血清培养基d.去成纤维细胞(2)体外培养上皮细胞的形态学变化(3)体外培养上皮细胞的生存状态体内：机体自身神经和内分泌因素体外：促细胞增殖因子和促细胞分化因子细胞增殖态细胞分化态体外培养上皮组织细胞的观察与检测1.一般形态学观察光镜：形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清电镜：桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液pH变化：颜色变化？培养物的污染情况：透明度变化？2.组织化

3、学与免疫组织化学观察与检测酶类：碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白血管内皮细胞的体外培养人脐静脉内皮细胞的培养组织来源：婴儿脐带培养用液：M199+20%FCSD-Hanks0.1%胶原酶溶液培养用具：1.主要材料：2.培养方法：分离细胞培养法(1)关于接种材料的制备取材与消化消化酶、浓度、时间(2)排除成纤维细胞传代去除法加肝素培养法(90u/ml)刮除法(3)关于培养液(4)关于传代培养5.讨论：(1)光镜检查(2)透射电镜检查：W-P小体(3)V

4、III因子相关抗原的免疫组化检测6.内皮细胞的鉴定：肾小管上皮细胞的培养1.主要材料：a.细胞来源：b.无血清培养液：基础培养液：DMEM/HamF12(1:1)添加物：胰岛素5g/ml转铁蛋白5g/ml硒5g/ml氢化可的松36ng/mlT34ng/mlEGF10g/mlc.消化液：0.2%胰蛋白酶d.细胞筛网：80和100目2.原代培养：切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm380目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养每隔3~4天，更换

5、培养液3.传代培养：4.培养结果：3d长出细胞5~7d进入对数生长期7~9d融合成单细胞层5.鉴定：抗角蛋白抗体染色（+）6.注意事项：a.分离方法：b.鉴定方法：巨噬细胞的培养巨噬细胞的培养动物：小鼠、大鼠、兔、人培养基：EagleMEMRPMI1640HamF12常用的巨噬细胞：肺泡和腹腔巨噬细胞获取巨噬细胞的方法（一）肺泡巨噬细胞支气管肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞1.小鼠腹腔巨噬细胞的获取：(1)主要材料：实验动物:6周龄小鼠培养液：10%FCSRPMI1640巨噬细胞的纯化1、原理：巨噬细

6、胞黏附能力强、贴壁快特点贴附培养时间贴附培养温度2.方法：常规差速黏附处理：低温差速黏附处理：巨噬细胞的接种和培养（一）主要材料：培养液：RPMI1640等+10~40%FCS+抗生素（二）实验步骤：a.冷分离b.调整细胞浓度：2~4×106/mlc.接种培养（三）培养结果：大小：20~50m形态：菱形、星形、圆形功能：吞噬功能增殖情况：不增殖、存活1~3周（四）巨噬细胞的鉴定1.吞噬实验：加入0.001M(finalcon.)SiO2吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力试验：0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反

7、复吹打细胞变园但不脱落3.细胞化学试验：ACP酶染色：棕黑色NSE酶染色：紫蓝色淋巴细胞的培养各类淋巴细胞的主要特征表面标志：1.表面受体：TCRSRBCRFcRMRMeaslesviruseRT淋巴细胞：MHCCD2.表面抗原B淋巴细胞1.表面受体BCRFcRCR丝裂原受体EBVR2.表面抗原MHC抗原CD抗原（CD19、20、21、23、45）血淋巴细胞的分离（一）单个核细胞的分离密度梯度离心法（二）纯淋巴细胞的制备1.玻璃黏附法2.羰基铁粉法（三）T、B淋巴细胞的分离1.T细胞花环沉降法2.尼龙毛柱分离法（四

8、）大颗粒淋巴细胞的分离（五）FACS仪分离（六）免疫磁珠法三、血淋巴细胞的体外培养应用（一）淋巴细胞转化试验（二）B细胞产生Ig的检查（三）T细胞介导的细胞毒试验（四）NK细胞毒性试验（五）K细胞毒性试验（六）LAK细胞的制备（七）TIL细胞的制备（八）淋巴细胞的体外长期培养1.用IL-2建立T淋巴细胞克隆2.用EB病毒转化B淋巴细胞3.用B细胞生长因子建立