第六章 柠檬酸发酵机制.ppt

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1、第六章柠檬酸发酵机制重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节；三羧酸循环的调节；难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖酵解及丙酮酸代谢的调节；第一节柠檬酸合成途径柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。柠檬酸合成途径：丙乙酰COA葡萄糖酮→柠檬酸酸草酰乙酸(参P53图4-1)EMP氧化脱羧羧化黑曲霉能够利用糖类、乙醇和醋酸生成柠檬酸。Jagnnathan等1953年证实黑曲霉存在EMP途径的所有酶；Ramakrishman和Martin等在1954-1955年间研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶素，证明了黑曲霉存在三

2、羧酸循环。柠檬酸积累，三羧酸循环阻断，合成柠檬酸所需的草酰乙酸如何得到？研究证实：草酰乙酸由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化形成。PYR+CO2+ATP草酰乙酸+ADP+PiKeq=0.818PEP+CO2+ADP草酰乙酸+ATPKeq=0.049碳平衡由葡萄糖生成柠檬酸的总反应式：丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶能量平衡由EMP途径底物水平磷酸化产生2个ATP，由氧化磷酸化产生9个ATP，可供菌体维持渗透功能等需要，不必再消耗碳源经由TCA循环产生能量。葡萄糖生成柠檬酸的碳和能量是平衡的第二节柠檬酸生物合成的代谢调节为什么黑曲霉能够大量

3、积累柠檬酸？柠檬酸引起反馈调节是如何进行的，而且最终被克服？；什么机制造成柠檬酸积累？一、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1.磷酸果糖激酶（PFK）是第一调节点在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶（PFK）有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，NH4+能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。研究表明:NH4+与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内NH4+浓度升高，使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。Mn2+的效应是通

4、过NH4+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制，NH4+水平升高是因Mn2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻。2.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。3.丙酮酸重要分叉点丙酮酸羧化酶不被乙酰CoA抑制，该酶的调节性差，从而保证了草酰乙酸的提供。二、三羧酸循环的调节1.TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA循环的第一个特点。2.顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶活性在pH2.0情况下，三种酶均不呈现活性。发酵中柠檬酸正是在该酸度下积累。柠檬酸是如何

5、开始积累？黑曲霉中一种单纯的，位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立如下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：73.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖和NH4+的抑制，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。此酶是TCA循环中唯一不可逆反应步骤。这时苹果酸、富马酸、琥珀酸由草酰乙酸生成，这种现象称为TCA循环的马蹄形表达形式。4.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。归纳：①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链解除磷酸

6、果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。③由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。复习思考题简述柠檬酸生物合成的代谢调节柠檬酸积累机制是什么？什么是乙醛酸循环？ThankYou!