猪繁殖与呼吸综合征病毒拮抗宿主蛋白IRF1和CH25H抗病毒活性的分子机制.docx

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1、猪繁殖与呼吸综合征病毒拮抗宿主蛋白IRF1和CH25H抗病毒活性的分子机制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害全球养猪业的重要病原,其具有快速演化和变异、拮抗宿主天然免疫等特性,这给PRRSV感染及其所致临床疾病的预防与控制造成巨大困难。因此,研究宿主天然抗病毒分子对PRRSV的抗病毒活性和PRRSV拮抗天然抗病毒分子的机制,对于理解PRRSV逃逸宿主天然免疫的机制以及寻找抗PRRSV天然分子具有重要的理论和实践意义。本研究分析干扰素调节因子1(IRF1)、胆固醇25羟化酶(CH25H)和25-羟基胆固醇(25HC)对PRRSV的抗病毒活性及其机制,

2、并探讨PRRSV拮抗其抗病毒功能的分子机制,以期为阐释PRRSV拮抗宿主天然免疫的机制和PRRSV防控新策略提供科学依据。采用慢病毒转导技术构建稳定表达猪IRF1基因的MARC-145细胞,分析过表达IRF1对PRRSV增殖的影响,结果显示,过表达IRF1可显著降低PRRSV的增殖滴度,表明IRF1可抑制PRRSV的复制;同时,采用siRNA干扰技术证实,敲低IRF1可促进PRRSV的复制。将PRRSV感染MARC-145细胞和PAMs然后检测IRF1的含量,结果显示,感染初期PRRSV上调IRF1的表达,感染后期PRRSV下调IRF1的表达。进一步的试验结果

3、表明,PRRSV的nsp1[、nsp10和nsp11下调IRF1的表达,nsp1β的His-159和nsp11的His-129、His-144和Lys-173是下调IRF1的关键氨基酸。采用蛋白酶体和溶酶体抑制剂阻断蛋白降解通路的方法证实,nsp1β通过溶酶体途径诱导IRF1降解,nsp10和nsp11通过蛋白酶体和溶酶体途径诱导IRF1降解。采用慢病毒转导技术构建稳定表达猪CH25H基因的MARC-145细胞,分析过表达CH25H对PRRSV增殖的影响,结果显示,过表达CH25H可显著抑制PRRSV复制。用25HC处理细胞来分析25HC对PRRSV复制的影响

4、,结果显示25HC对PRRSV的复制具有显著抑制效应。经病毒吸附、进入与释放试验和荧光定量PCR技术证实,25HC抑制PRRSV吸附和进入,而不影响病毒基因组的合成和病毒粒子的释放,且25HC对PRRSV无直接灭活作用。将PRRSV感染PAMs,然后检测的CH25H含量的变化,结果显示,PRRSV下调CH25H的表达;同时PRRSV的nsp1β和nsp11能诱导CH25H下调表达。采用突变体构建技术和共转染试验证实nsp1β的His-159和nsp11的His-129,His-144和Lys-173是下调CH25H的关键氨基酸。采用蛋白酶体和溶酶体抑制剂阻断蛋

5、白降解通路方法证实PRRSV的nsp1β和nsp11可通过溶酶体途径诱导CH25H的降解,且能拮抗CH25H的抗PRRSV活性。综上所述,本研究表明:(1)IRF1和CH25H具有抗PRRSV活性,25HC可通过抑制病毒吸附和进入而发挥抗PRRSV效应;(2)PRRSV的nsp1β可通过溶酶体途径诱导IRF1降解,而nsp10和nsp11可通过蛋白酶体和溶酶体途径诱导IRF1降解;(3)PRRSV的nsp1β和nsp11可通过溶酶体途径诱导CH25H的降解。以上结果为阐明PRRSV拮抗宿主天然免疫的机制以及为筛选抗PRRSV的宿主天然分子提供了科学依据,同时丰

6、富了PRRSVnsp1β、nsp10和nsp11的功能。