小鼠海马蛋白质影响管理论文.doc

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1、小鼠海马蛋白质影响管理论文【摘要】目的运用蛋白质组学技术观察益智健脑颗粒对SAMP8小鼠海马蛋白质表达的影响，从而探讨益智健脑颗粒治疗阿尔茨海默病(AD)的部分作用机制。方法将6月龄SAMP820只随机分为治疗组(n=10)和对照组(n=10)，治疗组以益智健脑颗粒浓缩液灌胃，对照组以等剂量双蒸水灌胃。8w后，应用双向凝胶电泳(2DE)技术分别分离治疗组和对照组SAMP8海马区组织总蛋白，经胶体考马斯亮蓝染色，利用ImageScanner图像扫描仪及ImageMaster双向凝胶电泳软件对图像进行扫描分析，将有意义的差异蛋白质点经基质辅助激光解吸电离飞行时间质

2、谱(MALDITOFMS)分析得到肽质量指纹图谱(PMF)，经MSDB和NCBI数据库查询，鉴定差异蛋白质点。结果鉴定出治疗组13个差异表达大于2倍的蛋白质，其中有8个上调，5个下调。结论益智健脑颗粒可调节SAMP8小鼠海马组织的多种蛋白质表达,提示该药具有多靶点治疗的作用。【关键词】益智健脑颗粒；SAMP8小鼠；海马；双向凝胶电泳；质谱分析益智健脑颗粒是董克礼教授多年临床实践治疗阿尔茨海默病(AD)的中药处方，临床上用于治疗AD之肾虚血瘀型,取得满意疗效〔1〕，动物实验研究能改善SAMP8小鼠的学习记忆能力〔2〕。本研究则在临床观察及前期动物实验的基础上，

3、应用蛋白质组学技术鉴定益智健脑颗粒干预前后P8品系快速老化小鼠(SAMP8)海马组织的差异表达蛋白质，试图从蛋白质组水平探讨中药益智健脑颗粒治疗AD的作用机制，为临床用药提供理论依据。1材料与方法1.1动物及分组选用6月龄20只雄性SAMP8小鼠，随机分为治疗组和对照组,每组各10只，由天津中医学院附属第一医院动物部提供。5学海无涯1.2药物、试剂与仪器益智健脑颗粒由淫羊藿、锁阳、川断、田七等组成，其水提浓缩液，相当于1ml含3g生药，由湖南德康制药有限公司加工制成。双向凝胶电泳试剂：2DQuantKit蛋白定量试剂盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX1

4、00，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干胶条（pH3～10，24cm），IPG缓冲液（pH3～10），两性电解质（pH3～10），覆盖液，双向凝胶电泳标准蛋白质，考马斯亮蓝G250,溴酚蓝均为瑞典AmershamBiosciences公司产品；琼脂糖，过硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸钠，碳酸氢铵，三氟乙酸、乙腈和基质α氰基4羟基肉桂酸均为美国SigmaAldrich公司产品。胰蛋白酶，美国Promega公司产品。PDQuest双向凝胶图谱分析软件是美国BioRad公司产品，MascotMS/MS

5、数据库查询软件是英国Matrixscience公司产品，IPGphor等电聚焦仪，Imagescanner扫描仪均为瑞典AmershamBiosciences公司产品，DataExplorer质谱分析软件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS质谱仪是美国AppliedBiosystem公司产品。1.3方法1.3.1动物喂养及标本收集治疗组和对照组小鼠喂养于层流室，温度18～22℃，湿度55%～58%，饮水及饲料高温蒸汽灭菌。小鼠灌胃剂量每天30g/kg计算。治疗组给予中药益智健脑颗粒浓缩液灌胃，1次/d。对照组给予相同体积的双蒸水灌胃，1次

6、/d，持续8w。8w后，迅速断头处死治疗组和对照组小鼠，置于冰上，剥出脑组织，用冷生理盐水冲洗干净，除去血渍，取出所需的海马，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。1.3.2海马组织总蛋白的提取及浓度测定将海马组织从液氮中取出，立即放入预先称重的EP管中进行称重。然后根据50mg样品组织加入约400μl组织裂解液的比例加入组织裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海马组织充分研磨

7、裂解，室温下静置孵育1h，间或涡旋混匀，然后1200r/min，4℃离心1h，吸取上清即为组织的总蛋白质。取少许（5μl）上清液（组织总蛋白质）测定蛋白质浓度。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2DQuantKit定量试剂盒测定蛋白质浓度。5学海无涯1.3.3双向凝胶电泳每块胶的上样量1500μg。将胶条槽放置于平台上，将样品加入胶条槽中，取出IPG干胶条（pH3～10）置入含蛋白质样品的胶条槽中，再将胶条槽平行放置于IPGphor等电聚焦仪上进行第一向电泳。等电聚焦电泳结束后，将胶条先后放在平衡缓冲A液(平

8、衡缓冲贮液10ml＋DT