Sanger&Solexa测序原理和流程.ppt

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1、测序原理和流程引物和PCR传统测序法——Sanger法新一代测序法——solexa引物和PCR什么是引物一小段单链DNA，用来引发PCR反应什么是PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应，是复制DNA的反应。做PCR的目的是什么扩增。由DNA链上的已知片段向特定的区域延伸，从而得到特定区域的DNA。变性5’3’5’3’3’5’3’5’引物复性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再变性首轮扩增结束再复性P1P1P2P2再延伸P1P1P2P2第二轮扩增结束P1P1P1P1P2P2P2P2第三轮扩增结束轮次长片段数

2、量目标片段数量120242368482251052612114………通过不断扩增延伸，长片段线性增长，而目标片段指数增长，最终反应主产物是目标片段PCR扩增NGF基因（大鼠）ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301gttctacactctgatcacagcgtttttgatcggcgtacaggcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaac

3、caatagctgcccgtgtga481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacggagactccgttc541accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc-3’Primer1:(5’)gatcggcgtacaggcagaac(3’)328-347Primer2:(3’)cgcggggtgaacggagtctc(5’)529-548预期扩增长度：220bpDNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100b

4、p220bp→通过胶图验证PCR是否成功PCR的特点和用途灵敏度高、特异性强1、获取DNA2、验证引物设计的基本原则有效：能结合到模板上引物自身没有消耗唯一：一定范围内不错配引物的自身消耗发夹结构：5’-ACATGAGGTACCAGCCCCATGT-3’5’-ACATGAGGTAC…

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11、3’-TGTACCCCGAC…引物二聚体结构：引物1：TACCGAACTCAGGGAACAGC

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20、引物2：GACTCCATTGCCTAGCCTGG引物设计的通常条件1、引物长度。15～30bp，通常设计引物都在18～27之间的范围内。太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能

21、量过高，不易结合。2、引物的3’端比5’端重要，5’端如果有个别碱基错配仍可结合，3’端如果有错配则不可结合。3’端尽量不要出现连续相同碱基。3、GC含量。通常在40%~60%之间容易进行PCR反应，过高或者过低都会增加反应难度。PCR的上下游引物GC含量不能相差太大。4、PCR的Tm值（退火温度）一般在55～70℃之间。（不同软件的计算差异很大，有时需要摸索条件）5、引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。Sanger测序法Sanger测序技术的发展70年代末，WalterGilbert发明化学法FrederickSanger发明双脱氧链终止法手动测序，同位素标记80年代中期，

22、出现自动测序仪（应用双脱氧链终止法原理）荧光代替同位素，计算机图象识别90年代中期，测序仪重大改进集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳2001年完成人类基因组框架图链终止法的原理：以单条DNA链为模板合成互补链。在合成原料（2’脱氧核苷酸）中掺入标记过的2’3’双脱氧核苷酸。合成互补链的反应会随机终止。而得到大量终止处带有标记的DNA片段。通过电泳分离这些片段来读出序列。脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸链终止法的核心仍然是PCR通过反应的随机终止，使读取序列成为可能峰图文件PHD文件BEGIN_COMMENTCHROMAT_FILE:rgbsda0_013779.y1.scfABI_THUMBP

23、RINT:0PHRED_VERSION:0.000925.cCALL_METHOD:phredQUALITY_LEVELS:99TIME:MonAug915:08:482004TRACE_ARRAY_MIN_INDEX:0TRACE_ARRAY_MAX_INDEX:5301TRIM:0648-1.00CHEM:unknownDYE:unknownEND_COMMENTBEGIN_DNAa2745c2753a3460t3466a3374END_DNAEND_SEQUEN