基因诊断课件.ppt

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1、第16章基因诊断王慧莲概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后基因诊断：是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断经历了三个基本发展阶段第一阶段：２０世纪８０年代，以DNA分子杂交为基础，通过限制性片段长度多态性性（RFLP)分析进行．第二阶段：应用PCR技术．第三阶段：应用基因芯片技术．第一节基因诊断的基础技术一.基因诊

2、断中常用的几种技术（一）核酸杂交（二）PCR（三）DNA序列测定（四）DNA芯片技术(一)核酸分子杂交技术(1)方法:以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析.(2)几种不同形式的核酸分子杂交a.Southern印迹(southernblot)杂交:用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等．b.Northern印迹(Northernblot)杂交:用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA

3、进行定性和定量分析．c.斑点杂交（dotblot):既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析．方法简单、灵敏；但特异性低．原位杂交（insituhybridization):是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术．可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断．分类:①玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片.②膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)原位杂交的镜像图(二)PCR技术在基因诊断中的应用（１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allelespecificoli

4、gonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针．在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交．杂交的结果有如下几种情况：①PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交--不存在这种突变；②只与突变探针杂交--突变基因为纯合子；③与正常探针和突变探针都可杂交--突变基因为杂合子；④与正常探针和突变探针都不能杂交--突变基因不属于已发现的类型（２）单链构象多态性（singlestrandconformationploymorphism,SSCP)分析是一种基于单链DNA

5、构象差别来检测点突变的方法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE中电泳中表现出不同的迁移率.SSCP特别适于分析小于400bp的PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质(3)限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）分析基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在

6、基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.限制性片段长度多态性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生

7、变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带．优点：可靠，检出单碱基突变率可达９５％．缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变．（５）用甲基化特异性PCR（methylation-specificPCR)进行分析在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)，在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可以进行甲基化特异性PCR．设计一对甲基化特异性引物（引物中G结合模板中C);和非甲基化特异性引物（引物中A结合模板中U),通过