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1、110细胞因子表达举例大肠杆菌表达系统用于外源蛋白表达已经取得了令人瞩目的成果,是基因工程多肽药物生产的基础。建立自己的高效表达系统将极大地促进我们的研究及开发工作。外源蛋白在大肠杆菌胞内表达,具有产量高、操作简便的优点。但许多外源蛋白在大肠杆菌中不能正确折叠,而是形成无活性不可溶的包涵体[1]。为获得高活性的功能蛋白,需要变性复性等一系列复杂操作,增加了工作难度和生产成本。2.2 ＰＣＲ扩增以ｐＨＢＧＦ质粒为模板,利用设计的引物扩增出ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ序列。条件为:94℃1ｍｉｎ,58℃1ｍｉｎ,72℃1ｍｉｎ,共30个循环。最后72℃延伸7ｍｉｎ。2.3 分子克
2、隆质粒提取、酶切、片段回收、连接、转化等操作均按照Ｓａｍｂｒｏｏｋ等人的方法进行[3]。2.4 ＤＮＡ序列测定采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测定。2.5 重组蛋白的表达ｐＳＥＧＦ分别转化大肠杆菌ＤＨ5α和ＨＢ101,得到工程菌。工程菌的培养与表达参照文献[4]进行。2.6 ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分别按照文献[3]方法进行。培养液离心,上清经丙酮沉淀后上样电泳。另外,菌体重悬于用冰预冷的20%葡萄糖,20ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓＨＣｌ,25ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ,ｐＨ8溶液中,冰浴10ｍｉｎ,13000ｇ离心,沉淀用预冷的20ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓＨＣｌ25ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ,ｐ
3、Ｈ8重悬,冰浴10ｍｉｎ,13000ｇ离心,取上清电泳分析[5]。2.7 重组蛋白活性测定细胞活性测定采用ＮＳＦ60细胞株。ＥＬＩＳＡ采用Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ公司的试剂盒,按说明书进行。3 实验结果3.1 表达载体的构建 以质粒ｐＥＺＺ18为背景[6],构建ｈＧＣＳＦ融合表达载体ｐＳＥＧＦ。在该系统中,外源基因表达由ｌａｃ启动子与金黄色葡萄球菌蛋白Ａ启动子双重控制,有利于外源蛋白的分泌。信号肽选用金黄色葡萄球菌蛋白Ａ的信号肽序列,可将外源基因的表达产物分泌到培养基中。另外在5’端含有两段人工合成的蛋白ＡＩｇＧ结合区的序列(ＺＺ),这可以极大提高外源蛋白的可溶性,提高
4、其分泌效率。因为表达产物为融合蛋白,为最终获得与天然蛋白结构一致的重组蛋白,我们在外源基因5’端引入蛋白酶ＦａｃｔｏｒＸａ识别位点。以ｐＨＢＧＦ质粒为模板,用ＰＣＲ方法扩增出人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物两端分别加入了ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点。ＰＣＲ产物经双酶切后,与以同样酶切过的ｐＥＺＺ18质粒连接,转化ＤＨ5α宿主菌,挑选阳性克隆。经ＤＮＡ序列测定分析,证实编码正确。得到ｈＧ－ＣＳＦ大肠杆菌融合分泌表达质粒,定名为ｐＳＥＧＦ(图1,图2)。3.2 ｈＧＣＳＦ的分泌表达将ｐＳＥＧＦ质粒转化ＤＨ5α宿主菌,在ＬＢ培养基中进行表达。过夜，培养液离心,取上清液
5、300μｌ,丙酮沉淀后ＳＤＳＰＡＧＥ,考马斯亮蓝染色。以ｐＥＺＺ18/ＤＨ5α培养液上清及ＤＨ5α培养液为对照。结果表明,在Ｍｒ34000附近,ｐＳＥＧＦ比对照多出一条带,和预期的融合蛋白的Ｍｒ一致(图3)。3.3 活性检测为进一步验证表达情况,培养上清液与菌体渗透液(Ｓｈｏｃｋａｔｅ)分别做ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ及生物活性检测。结果表明,表达产物和ｈＧＣＳＦ单克隆抗体有明显杂交信号。细胞测活的结果表明,该融合蛋白具有ｈＧＣＳＦ生物活性。ＥＬＩＳＡ检测亦证明了其活性。分泌表达是成功的。4 讨论大肠杆菌被内膜和外膜隔开形成胞内、周质和胞外3部分。在大肠杆菌中表达的外源重
6、组蛋白也可定位于胞内、周质空间或胞外培养基。其中,蛋白质跨过细菌的内膜定位于周质空间以及穿过细菌外膜到达胞外都可称作分泌(ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ)。利用大肠杆菌系统,在外源基因的Ｎ端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间。蛋白跨内膜后由细菌的信号肽酶将信号肽切除,获得具有天然一级结构(不含Ｎ端多余的甲硫氨酸)的产物。氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,从而获得具有完全生物学活性的重组蛋白。此外,周质间隙中蛋白水解酶与胞内相比少得多,使产物不易被降解,因而提高了重组蛋白的稳定性[7]。和胞内表达相比,分泌表达的主要问题
7、是表达量较低。在胞内表达中,常采用Ｔ7、ＰＬ等强启动子,外源蛋白多以包涵体形式存在,表达水平可达菌体总蛋白的10%～70%。而在分泌表达中,强启动子往往使重组蛋白也形成包涵体,影响分泌效果。因此,在分泌表达系统中常采用强度较弱的ｌａｃ等启动子。总之,分泌表达是一项经验性很强的工作,且不可预测,在所有因素都优化后,结果可能仍不能令人满意。目前达到工业化生产规模的很少。比较成功的例子是重组ｈＧＨ的分泌表达[15,16]。分泌表达技术进一步的发展还需依赖对细菌转运机制的深入研究。参考文献[1] ＷｉｌｌｉａｍｓＤＣ,ＶａｎＦｒａｎｋＲＭ,ＭｕｔｈＷＬ.Ｃｙ
