最新RT-PCR和real-time-PCR-原理及步骤教学讲义ppt课件.ppt

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1、RT-PCR和real-time-PCR-原理及步骤PCR定义聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。PCR原理10×扩增缓冲液4种dNTP混合物引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+加双或三蒸水荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段

2、任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。定量PCR的数学原理斜率与扩增效率标准品标准品梯度稀释方法1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA?使用方便--不必设计复杂探针?非常灵敏?便宜Taqman的优点对目标序列有很高的特异性特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单Taqman

3、的缺点价格较高只适合于一个特定的目标不能进行融解曲线分析分子信标的优点对目标序列有很高的特异性用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低分子信标的缺点设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高其他荧光标记方法绝对定量与相对定量的定义绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列

4、稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物相对定量通过内标定量内标（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量相对定量分析方法1-ΔΔCt前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,tes

5、t)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：2–ΔΔCT=表达量的比值相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度F=对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度样品●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之间●DNA用量：0.05ng–100n

6、g●RNA纯度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1uL气血精液广东省第二中医院针灸康复科气、血、津液，是构成人体的基本物质，也是维持人体生命活动的基本物质。气、血、津液，是人体脏腑、经络等组织器官生理活动的产物，也是这些组织器官进行生理活动的物质基础。气，是不断运动着的具有很强活力的精微物质；血，基本上是指血液；津液，是机体一切正常水液的总称。从气、血、津液的相对属性来分阴阳，则气具有推动、温煦等作用，属于阳；血和津液，都有是液态物质，具有濡养、滋润等作用，属于阴

7、。气、血、津液的生成，及其在机体内进行新陈代谢，都依赖于脏腑、经络等组织器官的生理活动；而这些组织器官进行生理活动，又必须依靠气的推动、温煦，以及血和津液的滋润濡养。因此，无论在生理还是病理的状况下，气血津液与脏腑、经络等组织器官之间，始终存在着互相依存的密切关系。　　此外，构成人体并维持人体生命活动的基本物质中还有“精”。“精”在中医学理论上的基本含义，有广义和狭义之分。广义之“精”，泛指一切精微物质，包括气、血、津液和从饮食中来的营养物质；狭义之“精”，即通常所说的肾中所藏之精，这种精与人的生长、发育和生殖，

8、都有直接关系。气、血、津液均为构成人体和维持人体生命活动的最基本物质，都离不开脾胃运化的水谷精气，因而气和血，气和津液，血和津液在生理上相互依存、相互制约、相互为用，病理上相互影响，互为因果。一、气的生成（一）生成之源先天之精气自然界之清气水谷之精气肾藏精肺主呼吸脾胃运化人体之气相关脏腑1、肾为生之根2、脾胃为生气之源3、肺为生气之主三、人体之