GBT27639-2011结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

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1、ICS11.220B41a园中华人民共和国国家标准GB/T27639--2011结核病病原茵实时荧光PCR检测方法Real—timePCRmethodforthedetectionoftuberculosispathogenicorganisms2011-12-30发布2012-04-01实施宰瞀鹊鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19刖吾GB/T27639--2011本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中

2、华人民共和国广东出入境检验检疫局、华中农业大学、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人:陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、吴晓薇。1范围结核病病原菌实时荧光PCR检测方法GB/T27639--2011本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物、血样、奶样、痰液、组织器官、粪便等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。2规范性引用文件下列文件对于本文

3、件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682--2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489--2008实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值:荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸。DMSo:dimethylsulfoxide,二甲基亚砜。EDTA:ethylenediamin

4、etetraaceticacid,乙二胺四乙酸。PBS:phosphatebuffersolution,磷酸盐缓冲液。PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。Taq酶:TaqDNA聚合酶。UDG酶:uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶。4原理本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA的引物,和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5’端标记了被称为报告基团的荧光素,3’端标记了淬灭基团。在进行P

5、CR延伸反应时,Taq酶的5’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来,使其与淬灭基团分离,从而仪器能检测到5’端荧光基团所发出的荧光信号,一分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加,仪器检测判的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光PCR检测方法(见表1)。其中,结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光PCR方法分别以IS6110、ISl081插入基因序列为模板设计特异扩增引物与探针;结核分枝杆菌、牛分枝

6、杆菌特异的实时荧光PcR方法分别以菌种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。】GB/T27639--2011表1荧光PCR引物与探针序列类别核酸序列上游引物:5’GcAGGGTTCGCCTACGTG3’结核分枝杆菌复合下游引物:5’CGGGTCCAGATGGCTTGC3’群(IS6110)探针‘:5LFAM-TGTCACCGACGCCTACGCTCGC3LBHQl上游引物:5’CCAGGAAcGCCTCAACC3’结核分枝杆菌复舍下游引物:5’CGACGAGGCGGATGATC3’群(ISl08D探

7、针‘:5,一FAM-AGAGGTACGCCGAACCGAC—BFIQ-1上游引物:5’CGGTGTAATCAGTTTTGAAGC3’结核分枝杆菌下游引物:5’CGATTGGAACGGCGAAGC3’探针‘:5’一FAM—TAGGTAGTCCAGTAGAGCCCCATAGCCA3’一BHC卜1上游引物:5’ACGCCTTCCTAACCAGAATTG3’牛分枝杆菌下游引物:5’GGCTATTGACCAGCTAAGATATCC3’探针‘:5’一FAM-AATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAA3LB

8、Hq-15探针5’端标记的报告荧光基团及3,端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。5材料与试剂5.1仪器与耗材5.1.1接种棒。5.1.2无菌注射器或真空采血管。5.1.3灭菌容器。5.1.4橡胶管。5.1.5刮匙。5.1.6Ⅱ级生物安全柜。5.1.7荧光PCR仪。5.1.8恒温水浴锅(室温至100℃)。5.1.9离心机(最高离心力达15000×g以上)。5.1.10混匀器。5.1.11冰箱(

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