DB22∕T 3091-2019 鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3091—2019鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法Real-timePCRmethodforthedetectionofTuberculosispathogenicorganismindeer本标准仅供内部使用不得翻印2019-12-25发布2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3091—2019本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-

2、2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学，中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：曾范利、李健明、时坤、宗颖、冷雪、赵丹、杜锐、徐超。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3091—2019本标准仅供内部使用不得翻印鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的试剂仪器、操作程序、结果判定。本标准适用于梅花鹿、马鹿组织器官、血液中的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本

3、文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语与定义本标准仅供内部使用不得翻印下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRReal-timePCR一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。3.2Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号量到达设定的阈值时

4、所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）5原理以DNA为模板进行PCR扩增，通过该反应，利用荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，是否获得目的基因，并最终计算待测样品模板的初始浓度。6试剂和材料1DB22/T3091—20196.1试剂除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。6.1.1

5、实时荧光PCR扩增所用的引物序列见表1。本标准仅供内部使用不得翻印表1引物序列类别核酸序列（5’-3’）上游引物5’-AGACCCCGGGACCTTCACTACAAC-3’结核分枝杆菌下游引物5’-AACGACTCCGCCCCAACTG-3’探针5’-FAM-ACGGTTTGTGTAGGATAGGTGGGA-TAMRA-3’上游引物5’-CGGGCGTTTTGTCGCATCC-3’牛分枝杆菌下游引物5’-GGGCGTGGGCAGACTTCGT-3’探针5’-FAM-CTTGCGGAGGAGGTTGGGGACA–TAMRA-3’6.1.2动物血液

6、与组织DNA提取试剂盒。6.1.3Taq酶。6.1.4磷酸盐缓冲液（PBS）(0.01mol/L,pH7.4)。6.1.50.5mol/LEDTA(pH8.0)。6.2材料6.2.1离心管（50mL、15mL、1.5mL）。本标准仅供内部使用不得翻印6.2.2吸头（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。6.2.3荧光定量PCR管。7仪器设备7.1电子天平，感量0.01g。7.2荧光定量PCR仪。7.3台式低温高速离心机（4℃，13000r/min）。7.4移液器（200μL～1000μL、20

7、μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。7.5恒温水浴锅。8生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应按GB19489和GB/T27401的有关规定执行。9操作步骤9.1样品的采集和保存9.1.1组织样品的采集和保存采集下颌、咽后、肺门、肠系膜淋巴结，肺，肝，脾等组织样品不少于5g。做好标识，置于密闭容器内，冷冻或4℃冷藏保存和运输。2DB22/T3091—20199.1.2血液样品的采集和保存使用EDTA作为抗凝剂，无菌采集静脉血不少于5mL，样品采集后于2℃～8℃冷藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过24

8、h，冬季不超过2本标准仅供内部使用不得翻印d）。短时间不能送达的样品应于-20℃冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，不应反复冻融。9.2DNA提取按照