gbt 27644-2011 禽疱疹病毒2型荧光pcr检测方法

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1、Ics11．220B41a宦中华人民共和国国家标准GB／T27644--2011禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法Protocolofreal—timePCRfordetectingGallidHepersVirus22011范围禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法本标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于禽疱疹病毒2型的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件GB／T27644—2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用

2、于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA：deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸。dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate三磷酸脱氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种脱氧核糖核苷。EDTA；ethylenediarninetetraaceticacid乙二胺四乙酸。GHV2：GallmHepersVirus2禽疱疹病毒2型(马立克氏病病毒血清1型)。MD：Marek’SDiseas

3、e马立克氏病。PBS：phosphatebelaneedsolution磷酸盐缓冲生理盐水。PCR：polymerasechainreaction聚合酶链式反应。Real—timePCR：Real—timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链反应。Taq酶：Thermusaquaticuspolymerase耐热DNA聚合酶。4试剂4．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。4．2禽疱疹病毒2型荧光PCR检测试剂盒，一20℃保存，组成及使用注意事项参见附录A。4．3引物和探针序列(

4、产物长度142bp)上游引物：5’CCACCACCTCCCATCTGTAC3’下游引物：5’GACAAGGCTGAGCGTAAAcc3’TaqMan探针：5’AcAcGGcTcGGTAAcAGGAcAcAATG3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。4．41％肝素钠，配制方法见B．1，4℃保存。4．5三氯甲烷，常温保存。1GB／T27644—20114．6异丙醇，使用前预冷至--20℃。4．7无水乙醇。4．875％乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。4．90．01mol／LPBS，pH7．2，配制方法见B

5、．2。5器材和设备5．1无菌注射器，1mL，5mL，10mL，25mL，100mL。5．2一次性无菌塑料袋。5．31．5mL无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。5．40．2mL无DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。5．5荧光PCR检测仪。5．6高速台式冷冻离心机，可控温至4℃、离心速度可达120009以上。5．7振荡器。5．8研钵。5．9普通冰箱和超低温冰箱：规格2℃～8℃，--20℃，一80℃。5．10微量移液器，0此～2pL，lpL～10止，10vL～100儿，20pL～200此，100止～1000pL，并配备与移液器匹配的无DNA酶和

6、RNA酶的吸头。6样品的采集和处理6．1样品的采集6．1．1全血用预先加入1％肝素钠的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendorf管中，盖上管盖并编号。6．1．2羽毛和组织脏器取待检羽毛OA根部挤出少量羽髓)、肝脏、肾脏和脾脏样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。6．2样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。6．3样品处理6．3．1全血30009离心30min，取棕黄色层转人无菌的1．5mLEppendor{管中，加入500pLPBS洗涤，30009离心15min，弃上清，编号备用。

7、6．3．2羽毛或组织脏器取待检样品2．0g加入2mLpH7．2的0．01mol／LPBS于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，分装编号备用。2GB／T27644—20116．4样本存放制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)，淋巴细胞样品在2℃～8℃条件下保存。7核酸提取及荧光PCR检测7．1注意事项实验室注意事项见附录C。7．2核酸提取7．2．1取n个灭菌的1．5mLEppendorf管(n为被检样品之和)，编号。7．2．2每管加入250pLDNA提取液(参见附录A)，然后分别加入被检样本各2

8、50pL，