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1、mi引物设计原则1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C,不适于TaqDN咪合酶进行反应。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG£CCC也会使错误引发机率增加。3.引物3'端的末位碱基对Taq酶的DN给成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。另
2、外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR5应失败。5'端序列对PC就响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的G*量不能相差太大。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72c左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。6.AG值是指DNAK链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性
3、。应当选用3'端AG值较低(绝又t值不超过9),而5'端和中间AG值相对较高的引物。引物的3'端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA＜合反应。7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PC阪应不能正常进行。8.对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。要
4、设计引物首先要找到DNAff列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+*量在40%~60无间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要避开密码子的第3位。1.引物的特异性引物与非特异
5、扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNAC级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA勺稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(4G)小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP^tdGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2(G+C+
6、(A+T),Ln值不能大于38,因为＞38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%其Tm值是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10C。若按公式Tm=4(G+C+2(A+T)估计引物的Tm信，则有效引物的Tm为55~80C,其Tm值最好接近72c以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧噬的存在。尤其3'端不
7、应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+CB集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3'端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。1.引物的3'端引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR反
8、应中，引物3'端不能发生错配。在标准PC阪应体系中，用2UTaqDNA®合酶和800^mol/LdNTP（四种dNTP各200仙mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3'端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A：A错配使产量下降至1/20,A：G和C：C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G模板A错配对PC
